The nitrate role of the reductase in soybean [Glycine max(L.) Merr. Cv IAC-17] under hipoxic conditions of the root system

Orientador: Ladaslav SodekDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A soja [Glycine Max (L.) Merr.] tem sido um dos modelos mais usados entre as plantas cultivadas para estudar os efeitos de tolerância à hipóxia, já que é tida como uma planta com certo grau de tolerância ao estresse de oxigênio e sua importância também tem um caráter econômico bastante relevante. Condições de hipóxia são comuns na natureza, por exemplo em campos alagados onde a difusão de oxigênio para o sistema radicular fica bastante prejudicada. Quando o estresse ocorre em tempo prolongado as conseqüências se tornam irreversíveis, levando as plantas à morte, uma vez que são tantos os prejuízos em função da injúria por carência de O2 que acarretam mudanças estruturais em organelas, por exemplo. Nesses casos, mesmo que a disponibilidade de O2 seja restabelecida, a planta não consegue se recuperar. Sabe-se, no entanto, que a presença do nitrato no meio contribui de forma a diminuir e/ou retardar as conseqüências desse processo, aumentando assim a tolerância das plantas a esta condição. Não é conhecido, entretanto, como o nitrato exerce seu efeito benéfico na tolerância à hipóxia. Alguns trabalhos vêm mostrando a ativação da enzima RN (redutase do nitrato) sob este tipo de estresse, um fenômeno que torna interessante a sua participação na tolerância induzida pelo nitrato. Por essa razão esse estudo teve os objetivos de: 1) otimizar método para extração da enzima RN em plantas de soja; 2) avaliar o papel da enzima RN em condições de hipóxia do sistema radicular e 3) Avaliar a utilização e metabolismo do nitrato em condições de hipóxia do sistema radicular. As plantas [Glycine max (L.) Merr. cv IAC-17] foram cultivadas em sistema hidropônico e após atingirem o estádio de desenvolvimento adequado (V4) foram submetidas à hipóxia (pela interrupção do fornecimento de ar comprimido e adição de uma camada de óleo mineral na solução nutritiva do vaso). O período de acompanhamento dos experimentos foi de 4 dias, tempo necessário para que o sistema radicular atingisse a hipóxia. Após esse período também foi estudada a recuperação das plantas do estresse, após a remoção da camada de óleo e restabelecimento da aeração. Foi observado que, independente do pH inicial, o pH da solução nutritiva das plantas em normóxia ficou estável em torno de 7,7 e o das plantas hipóxicas próximos a 6,6. O consumo de nitrato na solução nutritiva das plantas normóxicas e das hipóxicas foi praticamente o mesmo, também foi detectada a presença de nitrito na solução nutritiva dos tratamentos sob hipóxia. Durante o período de recuperação à normóxia, o nitrito acumulado na solução foi gradativamente utilizado. Quanto às raízes, observou-se que em normóxia ocorreu acúmulo de nitrato, enquanto que em hipóxia ocorreu a utilização do nitrato endógeno. Também foi observado nessas condições (hipóxia) o aumento na concentração de aminoácidos livres totais e proteínas em relação às plantas em normóxia. Na seiva do xilema de plantas sob hipóxia foi observada diminuição no teor de nitrato transportado, variação na composição dos aminoácidos livres presentes (aumentando significativamente a proporção de Ala e Gaba e diminuindo principalmente Asn) e aumento do teor de aminoácidos livres totais, em relação às plantas em normóxia. Nas plantas recuperadas, apenas o teor de proteínas da raiz e a composição de aminoácidos livres da seiva do xilema retornaram aos valores encontrados nas plantas normóxicas. Não foi detectada a presença de nitrito no sistema radicular e/ou seiva do xilema das plantas. A atividade da enzima RN foi bastante modificada durante o período de hipóxia diminuindo a valores bem baixos, assim como não houve sua ativação durante o estresse. Em apenas 1 dia de recuperação (retorno à normóxia), sua atividade atingiu os valores das plantas normóxicas. Chegou-se à conclusão de que embora o grau de utilização do nitrato pela planta seja semelhante em normóxia e hipóxia, o seu metabolismo é bastante alterado na hipóxia. Ao contrário do que foi relatado na literatura, a atividade da RN caiu bruscamente durante a hipóxia sem que houvesse evidência de ativação. No entanto, esta alteração na atividade da enzima pode explicar as diferenças no metabolismo do nitrato entre normóxia e hipóxiaAbstract: Soybean [Glycine Max (L.) Merr.] has been frequently used as a model system among cultivated plants in order to study the effects of tolerance to hypoxia, in view of its certain tolerance to oxygen deficiency and its relevant economic importance. Hypoxic conditions are common in nature, for example in flooded fields where the diffusion of oxygen to the root system suffers serious restrictions. When the stress occurs over a long period the consequences can become irreversible leading to the death of the plant in view of the many prejudicial factors arising from oxygen deficiency. These can result in structural changes in organelles, for example, from which the plant is unable to recover on return to normal oxygen availability. It is known, however, that the presence of nitrate in the surrounding medium can diminish or retard the consequences of oxygen deficiency, thereby increasing the tolerance of plants this stress. It is not known, however, what underlies the beneficial effect of nitrate in plant tolerance of hypoxia. Some investigations have shown that nitrate reductase is activated under oxygen stress, a phenomenon that might be related to the tolerance effect of nitrate. Therefore, this study had the objective of: 1) to optmize method for extraction of the RN enzyme in soybean plants; 2)evaluating the role of nitrate reductase during hypoxic stress of the root system and 3) evaluating the utilization and metabolism of nitrate under these stress conditions. Soybean plants [Glycine max (L.) Merr. cv IAC-17] were cultivated in a hydroponic system and after reaching the V4 stage of development were subjected to hypoxia by suspending aeration and applying a layer of mineral oil to the surface of the nutrient solution. The treatment was carried out for 4 days, time enough for the system to undergo hypoxia. Recovery from stress was also studied following hypoxia where the layer of mineral oil was removed from the surface and aeration of the solution restarted. The results showed that independent of the initial pH, the pH of the nutrient solution of normoxic plants stabilized at around 7.7 while that of the plants under hypoxia stabilized at 6.6. The consumption of nitrate in the nutrient solution of the normoxic and hypoxic treatments was practically the same, and nitrite was also detected in the nutrient solution of the plants under hypoxia. During recovery to normoxia, the accumulated nitrite was gradually used. As for the roots, it was observed that under normoxia, nitrate accumulated, while under hypoxia endogenous nitrate was consumed. Besides, under hypoxia, there was an increase in total free amino acids and proteins compared to the controls. In the xylem sap a decline in nitrate was found under hypoxia together with changes in the amino acid composition (where alanine and Gaba increased markedly while Asn diminished) and increases in the total amino acid levels. On return to normóxia only the levels of protein in the root and amino acid composition of the xylem sap returned to values found in the normoxic plants. No nitrite could be detected in the root tissue or xylem sap. Large changes in nitrate reductase activity were found during hypoxia, being reduced to low values. Nor was there any evidence for the activation of the enzyme during the stress. In less than one day on returning to normoxia activity returned tonormoxic plants levels. It was concluded that despite the similarity in the amounts of nitrate utilized comparing plants under normoxia and hypoxia, it was evident that its metabolism was quite different under these two conditions. Contrary to that reported in the literature, nitrate reductase activity falls drastically during hypoxia without any evidence for activation of the enzyme. Nevertheless, the alteration in activity could explain the differences in nitrate metabolism observed between for normóxia and hypoxiaMestradoMestre em Biologia Vegeta