Mecanotransdução em cardiomiocitos de ratos adultos submetidos ao estresse mecanico agudo : o papel da quinase de adesão focal (FAK) e do citoesqueleto

Orientador: Kleber Gomes FranchiniTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: o estresse mecânico é o principal fator responsável pelos ajustes funcionais e estruturais do miocárdio em resposta a sobrecarga de trabalho. Tal estímulo determina a ativação de uma intricada rede de vias de sinalização celulares que, por fim, culminam com o crescimento hipertrófico de cada cardiomiócito. A quinase de adesão focal (FAK) tem sido implicada como a principal molécula sinalizadora envolvida na resposta dos cardiomiócitos ao estresse mecânico. No entanto, os mecanismos da ativação da FAK pelo estímulo mecânico ainda não são conhecidos. No presente estudo investigamos a ativação e distribuição subcelular da FAK em cardiomiócitos submetidos à sobrecarga pressora aguda, visando assim contribuir para o melhor entendimento dos mecanismos de ativação da FAK pelo estímulo mecânico. A sobrecarga pressora por períodos de 3 a 60 minutos levou a fosforilação da FAK nos seus resíduos de tiro sina Tyr-397, -576/7, -861 e 925, conforme detectado pelos anticorpos fosfoespecíficos. Tal ativação foi paralela ao aumento da associação FAK/Src e simultâneo aumento da atividade da Src, constatada pela fosforilação da Tyr-418. A ativação do complexo FAK/Src foi ainda acompanhada pela ativação de efetores downstream, ERK e JNK (MAPKs), possivelmente reguladores de processos celulares vinculados a resposta hipertrófica. A análise por imunomicroscopia eletrônica com anticorpos contra a FAK demonstrou que em cardiomiócitos de ratos controle a FAK se encontrava preferencialmente localizada junto aos costâmeros, linhas Z, discos intercalares e filamentos do sarcômero. Além disso, a sobrecarga pressora por períodos de 3 a 60 minutos induziu a formação de agregados da FAK juntos a estes mesmo sítios subcelulares e, posteriormente, levou a translocação da FAK para o compartimento nuclear, dado este confirmado por :fTacionamentocelular. Paralelamente, estudo desenvolvido em nosso laboratório, com o emprego da metodologia de duplo híbrido em uma biblioteca de cDNA de rato adulto na busca de novas proteínas que interagissem com a FAK, revelou que esta quinase interage com a cauda da miosina de cadeia pesada (MHC). Este dado foi confirmado no presente estudo em ensaios de ligação com GST-miosina, que detectou a interação FAKlMHC em extratos ventriculares de ratos controle e sobrecarregados. A interação entre a FAK e a :MHCse encontrava aumentada em ventrículos esquerdos obtidos de ratos submetidos à sobrecarga hemodinâmica por 10 minutos se comparada aquela dos ventrículos controle, mas sofreu redução significativa em ventrículos esquerdos obtidos de ratos submetidos à sobrecarga pressora por 60 minutos. Dados similares foram obtidos para a FAK fosforilada em sua tirosina 397, conforme detectado com anticorpos fosfoespecíficos. ./ N'óssos resultados sugerem que a ativação da FAK pelo estímulo mecânico pode ocorrer junto a múltiplos sítios subcelulares (costâmeros, linhas Z, discos intercalares e filamentos de miosina), os quais atuariam como verdadeiros mecanosensores em cardiomiócitos, desempenhando importante papel na mecanotransdução de sinais decorrente do estresse mecânico. No mais, nossos dados sugerem ainda que a FAK pode desempenhar funções no compartimento nuclear relacionadas à resposta hipertrófica em cardiomiócitos submetidos ao estresse mecânicoAbstract: Mechanical stress is the major element responsible for functional and structural adjustments of the heart to overload. Such a stimulus activates an intricate net of cellular signaling pathways which, eventually, culminate with the hypertrophic growth of cardiac myocytes. FAK has been implicated as a signaling molecule involved in the early response of cardiac myocytes to mechanical stress. However, the mechanism of FAK activation by mechanical stirnuli is sti1lnot known. In the present study we investigated FAK activation and subcellular distribution in cardiac myocytes subjected to acute pressure overload in order to gain a better understanding of the mechanisms of FAK activation by a mechanical stimulus. Pressure overload lasting ITom3 to 60 min was shown to induce FAK phosphorylatio n at Tyr-397, - 576/7, -861 and -925 as detected by phosphospecific antibodies. This phosphorylation was paralleled by increased FAK/Src association and Src activity, as demonstrated by Tyr-418 phosphorylation. FAK/Src complex activation was accompanied by ERK and JUNK activation (MAPKs), which may regulate cellular processes related to the hypertrophic response. Immunogold analysis with antibodies against FAK showed that in cardiac myocytes ITomsham-operated rats Fak was closely associated with costameres, Z lines, intercalated discs and sarcomeric filaments. Furthermore, pressure overload lasting ITom3 to 60 min induced FAK to cluster at the same subcellular sites and at last translocate into the nuclei of cardiac myocytes. The translocation to nuclei was conftrmed by tissue ITactioning experiments. A parallel study in our laboratory employed the yeast two-hybrid screening of an adult rat c-DNA library and revealed an interaction between FAK and the C-terminal coiled-coil region of the alpha myosin heavy chain (MHC). This finding was conftrmed in the present study by performing GST-myosin binding assays, which detected the FAK/MHC interaction in both sham-operated and pressure overloaded left ventricles. The FAK/MHC interaction was shown to be increased in 10 min-overloaded left ventricles as compared to sham operated ventricles. However, a marked reduction of FAK/MHC interaction was observed in 60 min-overloaded ventricles. Similar findings were obtained for FAK397Y, as detected by phosphospecific antibody Our data suggest that FAK activation by mechanical stimulus can occur in association with multiple subcellular sites in cardiac myocytes (costameres, Z lines, intercalated discs, and myosin filaments). Thus, these site s may truly act as mechanosensors, exerting an important role in signal mechanotransduction trigged by mechanical stress. In addition, our data suggest that FAK may have functions in the nuclear compartment, which might be related to the hypertrophic response in cardiac myocytes subjected to mechanical stressDoutoradoCiencias BasicasDoutor em Clínica Médic