Analysis of the cDNA and deduction of the primary structure of a basic, neurotoxic PLA2 in vitro, of the crotoxina complex, from mRNA extracted of the whole venom of Crotalus durissus collilineatus

Orientador: Sergio MarangoniTese (mestrado) - Universidade Estadual de CampinasResumo: Enquanto estudos estruturais de toxinas de veneno de serpentes são feitos usando amostras de veneno, a construção de cDNAs precursores destas toxinas requer o sacrifício do espécime para a extração da glândula de veneno. No presente trabalho nós descrevemos uma técnica simples para isolar mRNAs presentes em amostras de veneno total. Para ilustrar esta técnica nós amplificamos através de RT-PCR um cDNA que codifica uma PLA2 049 (F6) do complexo crotoxina neurotóxica "in vitro" a partir do veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus. Estes achados implicam que a aparente ausência do mRNA em matrizes biológicas complexas não são sempre reais e facilitam a maneira de aquisição acelerada de dados micro evolutivos assim como de estrutura-função desta família de proteínas para serem utilizadas como ferramentas moleculares, sem o sacrifício do animal. O cONA que codifica PLA2 F6 do complexo crotoxina presente no veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus foi seqüenciada. A seqüência deduzida de aminoácidos deste cDNA codifica a PLA2 (F6) com alto grau de homologia seqüencial desta família de proteínas PLA2 do grupo 11, incluindo os 14 resíduos de cisteina capazes de dar forma a sete ligações dissulfeto que caracterizam este grupo de PLA2. A PLA2, foi isolada a partir do veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus através de coluna de cromatografia convencional de baixa pressão (8ephades G75) e por HPLC fase reversa. A massa molecular foi estimada por espectrometria de massa por MALDI - TOF. Para a identificação desta PLA2 (F6) como uma neurotoxina "in vitro", nós usamos a preparação biventer cervicis de pintainho. A análise filogenética da PLA2 (F6) da sub espécie Crotalus durissus collilineatus mostrou que os subtipos estruturais de N6-PLA2s com a substituição F24 ou 824 evoluíram paralelamente, possivelmente descendendo respectivamente das Protobothrops e a Gloydius dos dias de hojeAbstract: While structural studies of snake venom toxins can be achieved using venom samples, until now the construction of precursor cDNAs required sacrifice of the specimen for dissection of the venom glands. Here we describe a simple and rapid technique that isolation mRNAs present in whole venom samples. To iIIustrate the technique we have RT-PCR amplified the cDNA that it codifies a "in vitro" neurotoxic protein PLA2 049 (F6) from crotoxin complex, from the venom of snake sub specie, Crotalus durissus collilineatus. These findings imply that the apparent absence of mRNA in complex biological matrices is not always real and paves the way for accelerated acquisition of micro evolution as well as of structure-function of this protein family being used as molecular tools, without sacrifice of animal. The cDNA encoding PLA2 F6 from crotoxin complex in the whole venom of sub specie Crotalus durissus collilineatus venom was sequenced. The deduced amino acid sequence of this cDNA encoded PLA2 (F6) with high overall sequence identity of this protein family to the group 11 PLA2, including the 14 cysteine residues capable of forming seven disulphide bonds that characterize this group of PLA2 enzymes. The PLA2, were isolated from the whole venom of sub specie Crotalus durissus collilineatus by the conventional and low pressure chromatography (8ephades G75) column and the reverse phase HPLC. The molecular mass estimated by MALDI-TOF mass spectrometry. For the identified this PLA2 F6 like as a "in vitro" neurotoxin, we use the neuromuscular blocking activities were assayed with the chick biventer cervicis neuromuscular tissue. The sub specie' s Crotalus durissus collilineatus PLA2 (F6) phylogeny analysis showed that two structural subtypes of N6-PLA2s with either F24 or 824 substitution have been evolved in parallel, possibly descended respectively from species related to present-day Protobothrops and GloydiusMestradoBioquimicaMestre em Biologia Funcional e Molecula