Produção de oxido nitrico pela oxido nitrico sintase, nitrato redutase e uma atividade mitocondrial redutora de nitrito na resposta de defesa de Arabidopsis thaliana a Pseudomonas syringae

Orientador: Ione SalgadoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A origem do óxido nítrico (?NO) em plantas tem sido controversa e uma enzima do tipo óxido nítrico sintase (NOS), bem como nitrato redutase (NR) são consideradas possíveis fontes deste radical livre. Contudo, ainda não há nenhuma evidência direta da formação de ?NO a partir da NR durante interações planta-patógeno. Nos estudos aqui descritos foram utilizadas plantas de Arabidopsis thaliana deficientes na enzima NR para investigar o mecanismo de produção de ?NO em resposta à inoculação da bactéria Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm). Aumento na síntese de L-citrulina a partir de L-arginina foi observado em homogenatos de folhas de plantas do tipo selvagem e daquelas deficientes na síntese de NR, após inoculação com Psm. Experimentos de ressonância paramagnética eletrônica, contudo, mostraram uma produção muito maior de ?NO dependente de NO2-, mas não de L-arginina ou NO3-, síntese esta inibida por alta concentração de L-arginina. A inibição da cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria aboliu ou inibiu parcialmente esta atividade em plantas mutantes ou selvagens, respectivamente. A utilização do marcador fluorescente 4,5 diaminofluoresceína diacetato (DAF-2DA) mostrou que a inoculação com Psm aumentou substancialmente a produção de ?NO in situ em plantas selvagens, mas não em mutantes deficientes na síntese de NR. No entanto, a infiltração de L-arginina ou NO2- causou uma produção de ?NO in vivo nas plantas mutantes. Plantas de A. thaliana deficientes na síntese de NR mostraram suscetibilidade à P. syringae que foi prevenida pela co-infiltração de NO2-. O conjunto de resultados sugere que NOS, NR e uma importante atividade mitocondrial de redução de NO2- podem cooperar para produzir ?NO em quantidade suficiente para prevenir a disseminação de Psm em plantas de A. thalianaAbstract: The origin of nitric oxide (?NO) in plants has been controversial and nitric oxide synthase (NOS)-like enzyme and nitrate reductase (NR) are claimed as potential sources. However, there is still no direct evidence for ?NO formation from NR during plant-pathogen interactions. Here, we used NR-defective double mutants of Arabidopsis thaliana to investigate the mechanism of ?NO production following infection by an avirulent strain of Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm). Increased formation of L-citrulline from L-arginine was observed in leaf homogenates of both wild-type and nia1 nia2 mutant plants. Electron paramagnetic resonance experiments, however, showed a much higher ?NO production that was dependent on NO2- rather than on L-arginine or NO3- and was also inhibited at high L-arginine concentrations. Inhibition of mitochondrial electron transport abolished and inhibited partially this activity in nia1 nia2 mutants and wild-types, respectively. In situ ?NO production was substantially increased in wild type-plants but not in mutants, following Psm challenge, as measured with the fluorescent probe 4,5-diaminofluorescein diacetate. However, in vivo ·NO production in NR-deficient mutants was visualized only after L-arginine or NO2- infiltration into the leaves. A. thaliana plants defective in NR showed susceptibility to P. syringae that was prevented by infiltration of NO2-. The overall results suggest that NOS, NR, and an important mitochondrial-dependent nitrite-reducing activity cooperate to produce ?NO in amounts enough to prevent Psm dissemination in A. thaliana plantsDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula