Polifenoloxidase como fator de resistencia da soja a nematoides e na oxidação do palmito

Orientador: Paulo MazzaferaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A polifenoloxidase (PPO) há muito vem sendo estudada, seja na resistência em plantas a pestes e doenças, como também pela sua importância na indústria de alimentos. O primeiro capítulo apresenta o estudo da PPO da raiz de soja das variedades Cristalina (suscetível) e Hartwig (resistente) submetidas a dano mecânico, tratadas com metiljasmonato e infectadas com os nematóides Meloidogyne javanica e Heterodera glycines. Antes porém, uma rápida caracterização da PPO de soja mostrou que o triton X-100 aumentava a eficiência de extração, o dodecilsulfato de sódio (SDS) não aumentava a atividade e o ácido clorogênico era o melhor substrato da enzima. Nas plantas submetidas a dano mecânico e tratadas com metiljasmonato houve aumento da atividade da PPO, principalmente em Hartwig. Foi nesta variedade também a maior atividade detectada com a inoculação dos dois nematóides. As análises de fenóis totais não mostraram diferenças quantitativas ou qualitativas entre os tratamentos. Nos estudos moleculares foram isolados inicialmente cinco clones de PPO de raiz de soja, mas apenas dois destes fragmentos, JH1 e JH2, foram usados no preparo de sondas para estudos de Southern blot, que mostraram até 4 genes codificando para PPO. A análise de expressão por RT-PCR mostrou o aumento de transcrição somente com JH1, o que sugere que os genes para PPO não respondem da mesma forma ao mesmo estímulo. Cristalina tratada com metiljasmonato apresentou aumento de resistência a ambos os nematóides, enquanto em Hartwig não houve mudanças visíveis. No segundo capítulo foram feitas análises da PPO em folhas novas e velhas, raízes e palmito das palmeiras juçara, açaizeiro e pupunheira, onde maior atividade foi detectada em juçara, açaizeiro e pupunheira, respectivamente. De modo geral, folhas novas apresentaram maior atividade do que as velhas, e estas, atividade um pouco maior do que raízes. Na caracterização da PPO, o ácido clorogênico mostrou ser seu melhor substrato, com a melhor temperatura de reação entre 25oC (açaízeiro e pupunha) e 30oC (juçara). As melhores atividades foram observadas entre pH 5,5 e 6,0 do meio de reação. Houve inibição por inibidores específicos, tais como ácido salicilhidroxâmico, brometo de cetiltrimetilamônia e tropoleno. Os Ki's foram determinados para as PPOs de juçara e açaizeiro com ácido salicilhidroxâmico (2,82 µM e 1,96 µM, respectivamente) e tropoleno (6,55 µM e 1,25 µM, respectivamente). SDS levou à perda de atividade da enzima. PPO de juçara e açaizeiro mostrou-se relativamente resistente a temperaturas altas. O Km para ácido clorogênico foi menor para pupunheira (0,59 mM), seguido de juçara (1,19 mM) e açaizeiro (1,91 mM). Análises de fenóis solúveis totais e, ácido clorogênico mostraram que pupunha tem considerável quantidade de fenóis, semelhante até ao teor encontrado em açaí e um pouco superior a juçara, mas ácido clorogênico foi aproximadamente dez vezes menor em pupunha que nas outras duas palmeiras. ¿Tissue printings¿ de cortes do caule das palmeiras mostraram que pupunha apresenta pouca reação de oxidação devido à baixa atividade da enzima e não à uma possível menor quantidade de fenóis ou mais especificamente, de ácido clorogênico. Nos estudos moleculares, os mesmos primers detectaram seqüências de PPO em palmito de açaizeiro e juçara. Apenas um foi comum com palmito da pupunheira. Foram isolados dois clones de PPO, PPOEd17 (juçara) e PPOAc45 (açaí). Não foi possível isolar nenhum clone de PPO de pupunha. Estes fragmentos apresentaram similaridade baixa entre eles, ao redor de 52%, e foram usados na fabricação das sondas usadas no Southern blot, que indicaram a presença de apenas um gene nas três palmeiras. A análise de expressão por RT-PCR detectou transcrição significativa apenas nos palmitos de juçara e açaí, mostrando que a baixa oxidação observada em palmito pupunha se deve à baixa expressão do gene codificando para essa enzima. Ainda assim, a falta de substrato específico, o CGA, não pode ser excluída como um fator que contribui para a menor oxidação, pois as análises mostraram a presença de outros fenóis em pupunha em quantidades parecidas ou até superiores, mas que podem não ser tão bons substratos para a PPO, provocando a sua menor oxidaçãoAbstract: Most of the studies on polyphenol oxidase (PPO) are concerned with its participation in the response of plants to insect attack and its importance in food quality. The first chapter of this thesis presents the study of PPO from roots of two soybean (Glycine max) varieties differing in their resistance to nematodes. The aim was to study the role of PPO at the time of inoculation and consequently analyses were carried out at 6, 12, 24, 48 and 72 h after inoculation. Roots of Cristalina (susceptible) and Hartwig (resistant) were subjected to mechanical damage, treated with methyl jasmonate and inoculated with the nematodes Meloidogyne javanica and Heterodera glycines. Initial tests showed that the presence of triton X-100 in the extraction buffer increased the efficiency of PPO extraction. Sodium dodecylsufate (SDS) did not affect the enzyme activity and chlorogenic acid was the best substrate. Plants subjected to mechanical damage and treated with methyl jasmonate showed an increase of PPO activity, mainly in Hartwig. This variety also showed the highest activity following nematode inoculation. Analyses of phenolic compounds did not show quantitative or qualitative differences among the treatments. Using degenerate primers and PCR we isolated five clones of PPO from soybean root, but only two (JH1 and JH2) were used for Southern blot analysis. Probes made from these clones indicated 4 genes coding for PPO in soybean. Only JH1 showed an increase of PPO transcription with semi-quantitative RT-PCR based expression analysis. The results suggest that different stimuli might induce transcription of different PPO genes in soybean. Cristalina treated with methyljasmonate showed an increase of resistance to both nematodes, while no changes were observed with Hartwig. In the second chapter of this thesis PPO was studied in palm plants which differ in the oxidation of the extracted heart of palm (palmito). Analyses of PPO in young and mature leaves, roots and heart of palm showed that activity was higher in juçara (Euterpe edulis) and açaizeiro (Euterpe oleraceae). In general, the activity was higher in young tissues. Enzyme assay showed chlorogenic acid (CGA) as the best substrate and the best temperature reaction was 25ºC for açaízeiro and pupunha (Bactris gassipae) and 30ºC for juçara. The best activities of PPO were between pH 5.5 and 6.0. PPO was inhibited by specific inhibitors, such as salicylhydroxamic acid, cetyltrimethylammonium bromide and tropolone. Ki's were determined for salicylhydroxamic acid (1,96 µM for açaí and 2.82 µM for juçara) and tropolone (1.25 µM for açaí and 6.55 µM for juçara) with the PPOs from juçara and açaizeiro, respectively. SDS in the reaction medium led to the loss of activity of the enzyme. PPO of juçara and açaizeiro were relatively resistant to the temperature. The Km for chlorogenic acid was lower for pupunheira (0.53 mM), followed by juçara (1.19 mM) and açaizeiro (1.917 mM). Analyses of total soluble phenols and chlorogenic acid showed that pupunha has a considerable amount of phenols but a siginificantly lower amount of chlorogenic acid when compared with the other two palms. ¿Tissue printings¿ of cut stems of pupunha showed an absence of oxidation indicating that low activity of PPO and not low phenol was responsible two PPO clones were isolated, one from heart of palm of juçara (PPOEd17) and other from açaizeiro (PPOAc45). We were not able to isolate any clone from pupunha. These clones had low similarity (52%) and they were used as probes in Southern blot analysis. The results indicated that only one PPO gene was present in the three palms. Using semi-quantitative RTPCR based expression analysis it was possible to detect significant PPO transcription only in the heart of palm of juçara and açaizeiro, confirming that that low the oxidation observed in pupunha is due to low expression of the gene coding for PPO. However, the low chlorogenic acid content cannot be excluded as another factor contributing to the lower oxidation in this palm, since other phenols present would not be as good substrates as CGADoutoradoBiologia VegetalDoutor em Biologia Vegeta