Estudo citogenetico e molecular em pacientes com hipogonadismo hipogonadotrofico com e sem anosmia : sindorme de Kallmann e hipogonadismo hipogonadotropico

Orientador: Christine HackelTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A síndrome de Kallmann (SK) é uma afecção relativamente rara, caracterizada pela associação de hipogonadismo hipogonadotrófico (HH) e anosmia/hiposmia. Embora a maioria dos casos de SK seja esporádica, diferentes padrões de herança, recessivo ligado ao X, autossômico dominante e autossômico recessivo têm sido descritos, sendo que a forma ligada ao X da síndrome (SKX) encontra-se genotípica e fenotipicamente melhor definida. O gene KAL-1 localizado em Xp22.3 escapa à inativação e codifica uma proteína, a anosmina, cujo papel tem sido relacionado ao processo de migração de neurônios produtores de GnRH que ocorre durante a embriogênese humana. No entanto, muitos casos de hipogonadismo hipogonadotrófico não podem ser relacionados a qualquer alteração olfativa, sendo estes classificados como hipogonadismo hipogonadotrófico normósmicos (HHn). Mutações no gene do receptor do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH-R) têm sido descritas numa parcela desses casos. Além disso, os genes NELF (fator nasal embrionário do hormônio liberador de hormônio luteinizante) e EBF2 (¿early B-cell factor¿) têm sido relacionados ao processo de migração de neurônios produtores de GnRH, sendo considerados possivelmente envolvidos na gênese do HH. O presente trabalho foi elaborado com o objetivo de se investigar a base genética das diferentes formas do HH. Para tal, foram avaliados 31 indivíduos com hipogonadismo hipogonadotrófico (pertencentes a 26 famílias), 22 com anosmia e nove com olfação normal, mediante a análise do cariótipo pela técnica de bandamento GTG seguida da análise molecular dos genes KAL-1 e GnRH-R, por PCR e seqüenciamento. Todos os pacientes estudados apresentaram cariótipo normal, à exceção de um caso esporádico de SK com microdeleção do locus KAL-1 detectada somente por FISH em estudo anteriormente realizado. Entre os pacientes com SK, foram detectadas mutações na região codificante do gene KAL-1 nas três famílias com herança recessiva ligada ao X e em um caso esporádico. Duas famílias apresentaram duas deleções intragênicas similares envolvendo os éxons 5-10; na terceira família detectou-se uma mutação 721C>T no éxon 5 levando a um códon de parada prematuro. Esta mutação ainda não se encontra descrita na literatura. No caso esporádico identificou-se uma mutação ¿frameshift¿ 1956delC no éxon 12. Em relação aos pacientes com HHn, não foram identificadas mutações nos genes GnRH-R e KAL-1. Nesses casos, e nos pacientes com SK cuja etiologia não pôde ser esclarecida, foram ainda analisados os genes NELF e EBF2. Contudo, nenhuma alteração nas seqüências desses genes foi identificada entre os pacientes da nossa casuística. Em conclusão, não foram encontradas evidências cromossômicas da localização de outros genes candidatos responsáveis pelo surgimento do HH. Duas mutações novas e duas deleções intragênicas semelhantes foram identificadas no gene KAL-1 entre os casos esporádicos e familiais da SK, observando-se que essas mutações ocorreram numa freqüência relativamente elevada em nossa casuística. Os pacientes com HHn não apresentaram mutações nos genes KAL-1 e GnRH-R. Não foram observadas anomalias nas seqüências codificantes dos genes NELF e EBF2 em nenhuma das formas de HHAbstract: Kallmann syndrome (KS) is a relatively rare disorder characterized by the association of hypogonadotropic hypogonadism (HH) with anosmia or hyposmia. Although the majority of KS cases are sporadic, the syndrome may be transmitted as an autosomal dominant, autosomal recessive and X-linked modes of inheritance. The KAL-1 gene responsible for the X linked form of KS (X-KS) was mapped in Xp22.3 and encodes a protein called anosmin, that could function in the migration of GnRH-secreting neurons during embryonic development. However, many cases of hypogonadotropic hypogonadism do not have olfactory alterations, and are referred as normosmic hypogonadotropic hypogonadism (nHH). Mutations in the GnRH-R gene have been described in some of these cases. In addition, the NELF and EBF2 genes have been implicated in the neuronal GnRH migration and are considered promising candidate to HH manifestation. The aim of the present study was to investigate the genetic basis of different forms of HH. Thirty-one patients with HH (belonging to 26 families), 22 affected by KS and nine with normal olfaction, were evaluated by karyotype analysis using GTG banding technique followed by molecular analysis of the KAL-1 and GnRH-R genes, by PCR and sequencing techniques. All patients exhibited normal karyotypes, with exception of a previously studied KS sporadic case, where a microdeletion of the KAL-1 locus was detected only by FISH. Mutations were identified in the coding region of the KAL-1 gene in the three familial cases with X-linked inheritance and in one of the sporadic cases of KS. Two similar intragenic deletions involving exons 5-10 were observed in two families. In the third, a new point mutation on exon 5 (721C>T) leading to a premature stop codon was found, while a frameshift mutation caused by one nucleotide deletion (1956delC) within exon 12 was identified in the sporadic case. Mutations in the KAL-1 and GnRH-R genes were not observed in the patients with nHH. In these cases and in the KS patients without KAL-1 abnormalities, the coding sequences of genes NELF and EBF2 were analyzed. However, no mutation was detected in these genes in our sample. In conclusion, no chromosomal rearrangements or deletions that could be useful for the localization of other candidate genes responsible for HH were detected. Two new point mutations and two similar intragenic deletions of the KAL-1 gene were identified among sporadic and familial KS cases, with a relative high frequency in our sample. In the HHn patients, neither KAL-1 nor GnRH-R mutations were detected. No sequence abnormalities were demonstrated for the coding regions of the NELF and EBF2 genes in both forms of HHDoutoradoGenetica Humana e MedicaDoutor em Genetica e Biologia Molecula