Identificação e caracterização de genes expressos em resposta ao estresse por baixa temperatura em cana-de-açucar

Orientador : Paulo ArrudaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Estresses ambientais representam um dos principais fatores limitantes para a produtividade agrícola. Sendo assim, fazem-se importantes estudos que têm por objetivo analisar ao nível molecular os efeitos causados por esses estresses. Neste trabalho, analisamos o perfil de expressão gênica em plântulas de cana-de-açúcar submetidas a baixas temperaturas. Inicialmente, membranas de alta densidade (DNA macroarrays) contendo 1536 ESTs (Etiquetas de Seqüências Expressas) do projeto SUCEST (Sugarcane EST Project) foram hibridadas com sondas de cDNAs obtidas a partir de RNA total de tecido foliar de plântulas de cana-de-açúcar crescidas in vitro e submetidas a 4 oC por 3, 6, 12, 24 e 48 h. Como controle, foram utilizadas plântulas in vitro crescidas a 26 oC. O experimento foi repetido duas vezes, utilizando-se RNA total de novas plântulas tratadas e controle. Somente ESTs que apresentaram padrão de indução ou repressão semelhantes nos dois experimentos foram considerados para posterior análise. Desta forma, os resultados permitiram a identificação de 59 ESTs que foram induzidos ou reprimidos pelo estresse abiótico, dentre os quais alguns ESTs sem homólogos no GenBank. Alguns genes selecionados tiveram seu perfil de expressão confirmado por RNA-blot. Utilizando o banco de dados do SUCEST e seqüências de proteínas oriundas do NCBI, foi gerado um banco de dados contendo 33 proteínas de cana-de-açúcar relacionadas ao frio. Dentre essas proteínas foi identificada proteína similar a PUMP (Plant Uncoupling Mitochondrial Protein), a qual está envolvida em mecanismos de redução da produção de espécies reativas de oxigênio durante estresses abióticos. Posteriormente, quatro outras proteínas pertencentes à família PUMP foram identificadas no banco de dados do SUCEST, além de quatro proteínas pertencentes à família AOx (alternative oxidase). Análises filogenéticas corroboraram a hipótese da existência de novos membros de ambas as famílias de proteínas em cana-de-açúcar (Saccharum sp. PUMPs e AOxs, ou seja, SsPUMPs e SsAOxs, respectivamente) e em Arabidopsis (AtPUMPs e AtAOxs). Análise do perfil de expressão desses genes sugere que PUMPs e AOxs são expressos em órgãos diferentes em cana-de-açúcar e em Arabidopsis. Adicionalmente, resultados de RNA-blot sugeriram que dois membros da família de PUMPs (SsPUMP4 e SsPUMP5) e um membro da família AOx (SsAOx1c) foram induzidos por baixa temperatura (4 oC), enquanto que, em Arabidopsis, dois membros da família PUMP (AtPUMP4 e AtPUMP5) e um membro da família AOx (AtAOx1a) foram também induzidos pelo estresse abiótico, entretanto, com perfis diferentes. Interessantemente, o gene AtAOx1d foi reprimido após exposição das plantas a baixas temperaturas. Análises in silico demonstraram a existência de 26 membros da superfamília de proteínas NAC em cana-de-açúcar, incluindo um gene identificado em estudos de expressão gênica, denominado SsNAC23 (Saccharum sp. NAC23). Este gene foi completamente seqüenciado e posteriormente analisado. Resultados de RNA-blot sugerem que o gene SsNAC23 é regulado por baixa temperatura (4 oC), mas não por 12 °C, além de herbivoria (Diatraea saccharalis) e estresse hídrico (Polietilenoglicol, PEG 6000, 20%). Ensaios de localização subcelular demonstraram que a proteína SsNAC23 localizou-se preferencialmente no núcleo de células epidérmicas de cebola (Allium cepa). A construção de um modelo molecular do domínio NAC da proteína SsNAC23 permitiu a análise de determinantes estruturais possivelmente envolvidos em ligação a DNA, sugerindo seu papel como fator de transcrição. Alinhamento desses determinantes de outras proteínas contendo domínio NAC revelou alta conservação de importantes aminoácidos envolvidos no contato entre proteína e molécula de DNA. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a proteína SsNAC23 é um fator de transcrição envolvido em mecanismos de resposta a estresses bióticos e abióticosAbstract: Environmental stresses represent one of the main factors limiting crop productivity, being very important studies that aim to analyze, at a molecular level, the effects caused by these stresses. In the present project, we analyzed the sugarcane gene expression profiles in response to low temperature. Initially, high-density filter arrays containing 1536 ESTs (Expressed Sequence Tags) from SUCEST (Sugarcane EST Project) were hybridized with P33-labeled cDNA probes obtained from total RNA of sugarcane plantlets growing at 4 oC during 3, 6, 12, 24, and 48 h. As a control, plantlets growing at 26 oC were utilized. The experiment was repeated twice, being total RNA extracted from novel cold-treated and untreated plantlet sets. Only those ESTs, which presented similar expression profiles in both experiments, were taken into consideration for a further analysis. The results allowed identifying 59 ESTs that were induced or repressed by chilling stress. Selected genes had their expression profiles confirmed by RNA-blot analysis. Using SUCEST database and protein sequences from NCBI, a database containing 33 sugarcane proteins related to cold temperatures was generated. Among those proteins, we identified a PUMP (Plant Uncoupling Mitochondrial Protein) gene family member. This protein was reported to be involved in oxidative stress responses. Further, in SUCEST database, four additional proteins belonging to PUMP and four proteins belonging to AOx family (alternative oxidase) were identified. Phylogenetic analyses confirmed the existence of novel members of both protein families in sugarcane (Saccharum sp. PUMPs and AOxs: SsPUMPs and SsAOxs) and Arabidopsis (AtPUMPs and AtAOxs). Gene expression profile analyses suggested that PUMPs and AOxs are expressed in different plant organs. RNAblot results suggested that two members of sugarcane PUMP gene family (SsPUMP4 and SsPUMP5) and one member of AOx family (SsAOx1c) were induced by low temperature (4 oC). Arabidopsis PUMP4 and PUMP5 orthologs and one member of AOx family (AtAOx1a) were also induced by cold stress. Interestingly, AtAOx1d was down-regulated after plantlets were exposed In silico analyses demonstrated the existence of 26 members of sugarcane NAC domain protein family, including the cold-inducible SsNAC23 (Saccharum sp. NAC23). This gene was completely sequenced and analyzed. RNA-blot results suggested that SsNAC23 is modulated by extreme low temperatures (4 oC), but not at moderate ones (12 oC). SsNAC23 transcripts also accumulated in response to herbivory (Diatraea saccharalis) and PEG-induced water stress. Nuclear localization essays demonstrated that SsNAC23 was targeted to nucleus of onion cells (Allium cepa). A molecular model of the NAC domain of SsNAC23 allowed analyzing the structural determinants putatively involved in DNA-binding, evidencing the SsNAC23 transcriptional activator nature. Alignment of other NAC domain proteins revealed high structural determinants conservation in different plant species. In summary, our results indicated that the SsNAC23 is a transcription factor involved in biotic and abiotic stress responseDoutoradoGenetica Vegetal e MelhoramentoDoutor em Genetica e Biologia Molecula