Caracterização funcional do gene Bzo2h2 de Arabidopsis thaliana : um regulador da transcrição homologo ao locus Opaco2 de milho

Orientador : Michael Georges Albert VincentzTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O locus Opaco-2 codifica um fator de regulação da transcrição do tipo bZIP que atua no controle coordenado do metabolismo do carbono, nitrogênio e da síntese das prolaminas de reserva durante o desenvolvimento da semente de milho. Prováveis proteínas ortólogas e várias bZIPs similares a OPACO-2 foram identificadas e parcialmente caracterizadas em outras monocotiledôneas. A análise filogenética de um grupo e não redundante de bZIPs de plantas, incluindo os quatros genes de A. thaliana, Bzo2h1, Bzo2h2, Bzo2h3 e Bzo2h4, permitiu identificar um grupo de 20 proteínas homólogas à proteína O2, denominada de família O2. Bzo2h2 é um gene único que provavelmente representa uma função comum a monocotiledôneas e dicotiledôneas. Genes quiméricos a fim de promover o silenciamento gênico ou a superexpressão de Bzo2h2, assim como fusões traducionais da seqüência promotora desse gene com o gene marcador gusA foram introduzidos em A. thaliana. Um mutante nulo para Bzo2h2 também foi obtido a partir de um banco de mutantes de inserção de T-DNA. Bzo2h2 encontra-se expresso nos feixes vasculares, mais especificamente no floema de cotilédones, folhas, hipocótilo, raízes, flores e vagens. A localização in situ da presença do mRNA para Bzo2h2 através da técnica de hibridação in situ permitiu confirmar os resultados obtidos através da avaliação da atividade de GUS. Uma análise detalhada do padrão de expressão de Bzo2h2 ao longo do desenvolvimento revelou que a atividade de GUS já se encontra presente no procâmbio no estágio de maturação do embrião, indicando que mesmo antes de haver a diferenciação de xilema e floema, o gene Bzo2h2 já se encontra expresso, caracterizando assim um marcador de diferenciação do floema. A expressão específica de Bzo2h2 no floema sugere um possível envolvimento deste gene em algum aspecto da diferenciação deste tecido, já que ele se encontra expresso no procâmbio e no ápice de raízes, regiões onde o xilema e o floema ainda não se diferenciaram. Entretanto, análises histológicas da anatomia do feixe vascular de plantas superexpressando Bzo2h2 e do mutante nulo bzo2h2-1 não revelaram diferenças na organização e na estrutura do tecido vascular em relação a plantas selvagens. A ausência de fenótipo diferencial nas plantas silenciando Bzo2h2 e no mutante nulo bzo2h2-1 pode estar relacionada com o fato de que as condições testadas não permitiram evidenciar o processo no qual Bzo2h2 está envolvido, ou que as modificações são sutis e consequentemente de difícil percepção, ou ainda que algum grau de redundância funcional pode estar mascarando os efeitos das mutações em Bzo2h2. Juntos, os resultados levam à identificação de um gene que se mantém expresso ao longo de praticamente todos os estágios do desenvolvimento, exceto nos primeiros estágios embrionários, em todos os órgãos; e que parece não responder aos principais reguladores do crescimento e desenvolvimento, como fitohormônios, açúcares e estresses abióticos, como estresse osmótico, ausência de luz e baixa temperaturaAbstract: Opaque-2 (O2) is an important regulatory locus of maize seed endosperm development. O2 is involved in coordinated regulation of storage protein synthesis, nitrogen and carbon metabolism in developing seeds. O2 homologous genes were identified in both monocots and dicots, but probable O2 orthologous were only described in monocots. Phylogenetic analysis of a possible complete and nonredundant collection of angiosperm bZIP factors, including the four genes of A. thaliana, Bzo2h1, Bzo2h2, Bzo2h3 and Bzo2h4, resulted in the identification of 20 angiosperm O2 homologues that define the O2 gene family. Bzo2h2 is a unique gene which represents an ancestral function. Construction containing the cDNA in sense orientation under the control of a strong promoter was obtained for overexpressing Bzo2h2. Quimeric gene aimed at inducing gene silencing through RNA interference mechanism was also constructed. In addition, a construction with the promoter sequence of this gene fused to the reporter gene (gusA) was made, in order to define the expression pattern of Bzo2h2. Knockout mutant of Bzo2h2 was obtained. GUS activity analysis revealed that Bzo2h2 is expressed in vascular tissues of cotyledons, leaves, hypocotyl, primary and lateral roots, flowers and siliques. Cross sections of roots and leaves revealed that its expression is specific of the phloem. In situ hybridization analysis confirmed the previous results. GUS activity also revealed that Bzo2h2 expression is present in the procambial cells during the embryo maturation stage. In this stage the xylem and phloem are not differentiated yet. This suggests that the Bzo2h2 gene may be involved in the differentiation of this tissue. Cross sections of roots and leaves of overexpressing Bzo2h2 and Knockout Bzo2h2 mutant plants revealed that vascular tissue organization and structure was not altered when compared to the wild type plants. The lack of visible phenotypes in knockout mutant and overexpression plants could be attributed to functional redundancy or inability to detect weak phenotipic changes. We have identified a gene that express through the whole life cycle of plant, except in the early embryogenesis, in all organs and doesn¿t respond to the growth regulators such as phytohormones, sucrose and abiotic stress (osmotic stress), darkness and low temperatureDoutoradoGenetica Vegetal e MelhoramentoDoutor em Genetica e Biologia Molecula