Isolamento e caraterização genotipica e fenotipica de amostras de Escherichia coli isoladas de bezerros no estado de São Paulo, Brasil

Orientadores: Antonio Fernando Pestana de Castro, Jorge Blanco AlvarezTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Foram isoladas 98 amostras de Escherichia coli, portadoras dos genes eae, stx, ou ambos, entre 264 bezerros diarréicos e 282 bezerros sadios, com idade entre 4 a 5 meses. Uma vez positivas em PCR para 1 ou ambos os genes, as amostras foram estudadas quanto presença de genes que codificam para enterotoxinas e citotoxinas: Termo lábil I (LT-I), Termo lábil li (LT-lI), Termo estável a (Sta), Termo estável b (STh), Fator necrotizante citotóxico 1 (CNF1), Fator necrotizante citotóxico 2 (CNF2), EaggEC heat-stable toxin 1 (EAST1) e Enterohemolisina (Eh1y), sendo que Eh1y foi testado também quanto a sua expressão, em ágar sangue. Entre os animais diarréicos, obtivemos 27 animais (10,2%) stx positivos e 15 animais (5,68%) eae positivos e entre os animais sadios, obtivemos 22 (7,8%) stx positivos e 17 (6,03%) eae positivos. Genes para CNF foram encontrados entre 5 (1,9%) animais diarréicos e 4 (1,4%) animais não diarréicos. LT-lI foi encontrada em uma única amostra isolada de um animal diarréico. Ehly foi encontrada em 20 (7,6%) animais diarréicos e 22 (7,8%) animais sadios. O gene ast1 foi encontrado em apenas 2 animais, sendo um diarréico e um sadio. Dos genes que codificam para as adesinas pesquisadas (BFP e Saa), somente saa foi encontrado (22mnostras),sendo-queoplasmídio EAF não esteve presente. As amostras eae+ foram pesquisadas através de PCR quanto ao subtipo de intimina apresentado, sendo que 17 amostras foram positivas para o subtipo 131, 15 amostras foram positivas para o subtipo y2, 3 amostras foram positivas para E, 2 amostras apresentaram-se ç+ e 1 amostra apresentou-se µ1+. As 10 amostras restantes apresentaram intimina Não Tipável. Também testamos estas amostras quanto à produção da lesão AlE, através do teste de F AS, sendo que 33 amostras apresentaram-se positivas neste teste, 10 apresentaram-se negativas e 5 não puderam ser testadas, pois não aderiram à linha celular HEp-2. Quando testamos estas amostras eae+ quanto à inserção de LEE, a grande maioria (37 amostras) apresentou pheU interrompido, indicando uma provável presença de LEE inserido neste locus. Todas as amostras foram testadas quanto à aderência em células HEp-2. Dez amostras apresentaram aderência Difusa (10,20%), 14 apresentaram aderência Agregativa (14,3%), 17 apresentaram aderência Localizada-like (17,3%), 26 apresentaram aderência Não Característica (26,5%) e 25 (25,5%) foram negativas para este teste. Uma amostra demonstrou aderência do tipo Cover Slip (1%) e 5 amostras provocaram descolamento do tapete celular (5%). O teste de Separação Imuno-Magnética (SIM) não favoreceu o isolamento de nenhuma amostra de E. coZi do sorogrupo 0157 entre as 50 amostras de carne bovina crua e 50 amostras fecais testadasAbstract: Ninety eight strains of Escheríchía colí fTom 264 diarrheic calves and 282 hea1thy ones were studied. Screening was made based on the presence of genes eae, stx or both. These 98 strains were also tested for presence of genes encoding toxins: LT-I, LT-II, STa, STh, CNFl, CNF2, EASTl and Ehly. Twenty seven diarrheic calves (10,2%) were positive for stx genes and 15 (5,7%) were positive for eae gene. Among the hea1thy calves twenty two (7,8%) were positive to stx genes and 17 (6,0%) were positive to eae gene. The genes for CNF were isolated fTom 5 (1,9%) diarrheic calves and 4 (1,4%) non diarrheic ones calves. Only one strain Itll+ was isolated. The Eh/y was founded in 20 (7,6%) diarrheic calves and in 22 (7,8%) healthy caIves. When the 98 strains were tested for presence b.fp, eaf or saa genes, we only found 22 saa positive strains. From eae+ strains studied,17 were positive togene for _1 intimin subtype, 15 were positive to y2 subtype, 3 were positive to & subtype, 2 were positive to ç; subtype and only one strain was positive to the gene encoding to J.I. subtype. The 10 remaining strains were non-typable. Among the eae+ strains, 33 were positive in the Fluorescence Actin Staining test (FAS) and 14 strains react with anti intimin antisera used in Westem blot. These 48 eae+ strains were tested by PCR to determine the local of LEE insertion into the E. colí chromosome. pheU interrupted was observed in 37 strains indicating that LEE is probably inserted in this locus. By the cell culture assay in HEp-2 cells, 10 strains (10,2%) showed diffuse adesion (DA), 14 enteroaggregative adhesion (14,3%), 17 (17,3%) localized like adhesion (LAL), 26 (26,53%) strains showed no characteristic adhesion (NC), 1 strain showed cover slip (CS) adhesion and 25 strains were no adherent to HEp-2 cells. No 0157 strains were isolated by Imunno Magnetic Separation (IMS), either fTom the 50 raw meat or fecaI specimens examined.DoutoradoMicrobiologiaDoutor em Genetica e Biologia Molecula