Estabelecimento do protocolo de micropropagação da especie nativa Baccharis tridentata (Asteraceae) : estudos fisiologicos, anatomicos e histoquimicos in vitro

Orientador: Simone Liliane Kirszenzaft ShepherdTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Várias espécies do gênero Baccharis têm sido usadas na medicina popular. Efeitos farmacológicos de muitas delas já foram comprovados, e, nos últimos anos, os compostos químicos de mais de 60 espécies foram identificados. No entanto, são raros os estudos biotecnológicos em espécies deste gênero. B. tridentata e B. dracunculifolia são plantas nativas, aromáticas e produzem óleo essencial, no qual os sesquiterpenos em maior concentração são: nerolidol, espatulenol e b-cadineno. Recentemente, foi comprovado o efeito inibitório do nerolidol no crescimento de Plasmodium falciparum, o mais perigoso agente causador da malária. Devido a alta mortalidade causada por esta doença e ao fato deste parasita estar se tomando resistente aos medicamentos convencionais, pesquisas com plantas que apresentam potencial terapêutico são importantes. Com a finalidade de obter rapidamente um grande número de plantas com as mesmas características da planta mãe, foram desenvolvidos protocolos de micropropagação para as duas espécies. A micropropagação de B. tridentata foi estabelecida através de ápices caulinares de uma única planta, permitindo a formação de um banco de plantas homogêneas (done) que foram utilizadas como fonte de explantes para os experimentos posteriores. Foi desenvolvido o protocolo de aclimatação para esta espécie, com 80% de sobrevivência das plantas deste done no ambiente ex-vitro. Já para B. dracunculifolia, devido a intensa oxidação dos explantes, a micropropagação foi possível somente através da germinação de sementes. A forte recalcitrância ao cultivo in vitro dificultou o prosseguimento dos experimentos com esta espécie. A espécie B. tridentata cresce em pequenas cavidades nas superficies rochosas do Planalto do ltatiaia. A peculiaridade deste habitat levou-nos a realizar alguns estudos fisiológicos in vitro, visando contribuir para a compreensão de alguns mecanismos de adaptação desta espécie, além de permitir o aperfeiçoamento do protocolo de micropropagação. Foram avaliados os efeitos da variação do pH inicial, da fonte preferencial de nitrogênio e da concentração de alguns macronutrientes no crescimento. Após 31 dias de cultivo, o crescimento das plantas resultou em acidificação do meio, com pH final de 3,5. Este clone apresentou maior crescimento (altura e massa de matéria seca) com fonte de nitrogênio constituída de mistura de NO3-+NH/, quando comparado com NO3- ou NH/ fornecidos isoladamente. O aumento do peso seco das raízes foi favorecido pela diminuição da concentração de magnésio no meio. Estudos recentes têm demonstrado que as culturas de partes aéreas podem constituir fonte viável de compostos secundários úteis, principalmente aqueles produzidos em estruturas altamente diferenciadas, como os tricomas glandulares (TG). Entretanto, plantas cultivadas in vitro apresentam, em geral, menor produção destes compostos, quando comparadas com aquelas cultivadas em campo. Esta baixa produção do cultivo in vitro tem sido relacionada com o menor grau de diferenciação. Este presente trabalho investigou os efeitos de alguns fatores microambientais, nutricionais e fitohormonais na diferenciação de algumas estruturas foliares, especialmente os TG, de um clone de B. tridentata cultivado in vitro. As plantas cultivadas in vitro apresentaram TG morfologicamente semelhantes aos da planta da casa de vegetação e do clone aclimatado. A utilização do tampão de algodão no frasco de cultura (em substituição ao PVC utilizado comumente como vedação) resultou em maior diferenciação das células paliçádicas do mesofilo. Neste tratamento, foi observado espaço subcuticular formado pela distensão da cutícula dos TG, sugerindo a secreção de material. O uso da vedação de algodão alterou o microambiente do frasco de cultura (diminuição da umidade e alteração das trocas gasosas) e provavelmente, favoreceu a diferenciação destas estruturas foliares. Outra alternativa para aumentar a produção de compostos acumulados nos TG é através do aumento da densidade destas estruturas (número de TG/mm2). Desta forma, investigamos o efeito dos mesmos fatores microambientais, nutricionais e fitohormonais, acima mencionados na densidade dos tricomas, em folhas adultas do clone de B. tridentata cultivado in vitro. Plantas cultivadas em casa de vegetação e clone aclimatado apresentaram maior densidade de TG do que o clone cultivado in vitro. Nos três casos a densidade dos TG foi maior na epiderme superior. Entre os tratamentos aplicados às plantas cultivadas in vitro, foi constatada interação altamente significativa da concentração de sacarose e fotoperiodo. A maior densidade foi favorecida pela luz contínua e 3% de sacarose. Embora o número de TG/mm2 (otimizado) obtido in vitro tenha sido menor do que o apresentado pelas plantas cultivadas em casa de vegetação e pelo done adimatado, ele foi significativo, principalmente se considerarmos o curto tempo de cultivo (31 dias). Portanto, há possibilidade de melhorar estes resultados, aumentando o tempo de exposição aos tratamentosAbstract: Several species of the genus Baccharis have been used in folk medicine. Pharmacological effects of many of them were confirmed, and, in the last years more than 60 species have been investigated chemically. However, biotechnological studies are rare. B. tridentata Vahl. and B. dracunculifolia De. are native, aromatic plants and they produce essential oil, in which nerolidol, sphatulenol and b-cadinene are major sesquiterpenes. Recently, was demonstrated the inhibitory effect of nerolidol on the growth of Plasmodium falciparum, the most dangerous species that causes malaria. Due the high mortality caused by this disease and the fact of this parasite is becoming resistant to conventional drugs, researches with plants that present therapeutic potential are very important. With the purpose of obtaining a great number of plants with the same characteristics of parents plants, and quicky, micropropagation protocols were developed. The micropropagation of B. tridentata was stablished through shoot apex of a single plant, allowing the formation of homogeneous plant bank (done), with served as explant sources for later experiments. The acc1imatization of micropropagated plants was successful with 80 % of survival in the ex-vitro environrnent. For B. dracunculifolia, due to intense oxidation of explants, the micropropagation was only possible through the germination of seeds. The strong recalcitrant behaviour to the in vitro culture hindered to following the experiments ofthis species. Plants of B. tridentata grow in small cavities on the rocky surfaces of the Itatiaia Plateau. The peculiarity of this habitat took us to accomplish some in vitro physiological studies, seeking understanding adaptation mechanisms of this species, besides allowing the improvement of the micropropagation protocol. We verified the effects of the initial pH variation, the preferential nitrogen source and the concentration of some macronutrients on the growth. After 31 days of in vitro culture, the growth of done resulted in media acidification, with final pH as 3,5. The clone presented larger growth (heigth and dry matter) with NO3 +NH/ mixture, when compared with NO3- or NH4 -r supplied separately. The decrease of magnesium concentration in the culture media favoured the increment of dry matter by roots. Recent studies have demonstrated that shoot cultures can be a viable source of useful secondary compounds, mainly those produced in highly differentiated structures, as glandular trichomes (TG). However, in vUro cultured plants present, in general, smaller production compared with greenhouse grown plants. The lower production feature of in vitro cultured plants has been related with little differentiation degree. This present work investigated some microenvironrnentals, nutritional and phytohormonals factors in the differentiation of clone leaf structures, especially glandular trichomes. TG of tissue cultured plants were morphologically similar to that of greenhouse grown plants and acc1imated clone. The use of cotton lid in the culture vessel (in substitution to pvc closure) resulted in larger differentiation of palisade mesophyll cells. In this treatment, a subcuticular space formed by the detachment of cuticle were observed on the glandular trichomes, suggesting the production of secretory material. The use of cotton lid changes the vessel microenvironrnent (decrease of the humidity and increase of gaseous exchange) and probably, enhanced the leaf structures differentiation. Another altemative to increase the production of TG produced compounds is through the increase of the density of these structures (number of TG/mm2). This way, we investigated the effect of the same microenvironrnentaI, nutritional and phytohormonals factors, in the density of trichomes, in adult leaves of tissue cultured clone. Greenhouse grown plants and acc1imated clone presented larger density of TG than in vitro cultured plants. The density of TG was always larger in adaxial epidermis. Among the treatments applied to the in vitro cultured clone, there was highly significant interation of the sucrose concentration and photoperiod on the trichomes number. The largest density was favoured by the continuous light and 3% of sucrose. Although the best results of TG density obtained in the tissue cultured plants has been smaller than greenhouse grown plants and acclimated clone, the in vitro results were significant, mainly, if consider the short time of culture (31 days). Thus, there is possibility to improve these results increasing the time of exposure to the treatmentDoutoradoDoutor em Biologia Vegeta