Virus do amarelecimento foliar da cana-de-açucar : caracterização e estudo comparativo entre variedades com diferentes respostas a infecção viral

Orientador: Jorge VegaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A Síndrome do Amarelecimento Foliar da Cana-de-Açúcar é atualmente uma das principais preocupações da cultura canavieira no Brasil e em todos os países produtores desta gramínea. Em função da importância deste problema, muitos estudos foram realizados na tentativa de se descobrir o agente causal desta síndrome, originando controvérsias sobre a sua origem. A fim de se obter dados que contribuíssem para um melhor conhecimento do problema, foram estudados neste trabalho a caracterização do seu agente causal, as formas de transmissão do agente causador, seu círculo de hospedeiras e alguns aspectos do comportamento fisiológico das variedades infectadas. Os sintomas típicos da doença, que se iniciam com o amarelecimento da nervura, foram reproduzidos quando um vírus foi transmitido de plantas infectadas para plantas sadias de cana-de-açúcar, pelos afideos Melanaphis sacchari e Rhopalosiphum maidis, indicando ser este vírus o agente causador da doença. Das espécies de plantas testadas com estes afideos, apenas Saccharum sp. mostrou-se como hospedeira conhecida do vírus. Uma vez comprovada a etiologia viral desta doença, foi então identificado um luteovirus associado a esta síndrome e identificado como Vírus do Amarelecimento Foliar da Cana-de-Açúcar (Sugarcane Yellow Leal Virus - Sc YL V). Testes de transmissão mecânica do vírus foram negativos. As propriedades das partículas virais foram obtidas através da purificação do vírus, cuja metodologia também foi estudada neste trabalho. Após otimização do método de purificação, as partículas virais mostraram um diâmetro aproximado de 25 a 28 nm, quando observadas ao microscópio eletrônico e contrastadas com ácido fosfotúngstico, pH 5,0, apresentando uma densidade de 1,30 glcm3 em gradiente de CS2SO4, e um genoma de 5,8 kb (ssRNA). A proteína do capsídeo viral apresentou uma massa molecular relativa aproximada de 27 kDa e não era glicosilada. Anticorpos policlonais contra o Sc YL V foram produzidos em coelhos e detectaram eficientemente o vírus homólogo. Este mesmo anti-soro não detectou nenhum dos outros luteovirus utilizados, BYDV (Barley Yellow Dwarf Virus), PLRV (Potato Leafroll Virus), BWYV (Beet Western Yellows Virus) e BLRV (Bean Leafroll Virus), através dos testes serológicos de ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) e ISEM (ImmunoSorbent Electron Microscopy). Do mesmo modo, quando anti-soros preparados para estes luteovirus foram testados em plantas de cana-de-açúcar infectadas pelo Sc YL V, os resultados também foram negativos. No entanto, além de sua detecção pelo anti-soro homólogo nos testes de ELISA e ISEM, o Sc YL V também pôde ser detectado nos testes de Westem-blot utilizando-se de anti-soro preparado para o isolado RPV do BYDV, sugerindo um grau limitado de relação serológica entre estes luteovirus. Foi concluído então, que o ScYLV é um luteovirus biologicamente e serologicamente distinto dos outros membros do grupo já descritos. Utilizando-se do anticorpo policlonal aqui produzido, a técnica de DAS-ELISA pôde então ser padronizada e usada rotineiramente para diagnóstico, após a produção específica de conjugado homólogo para este Vírus. Em relação à manifestação dos sintomas induzidos pela doença, foi observado que a expressão destes varia de acordo com a variedade infectada e com fatores climáticos. Foi estabelecido então, uma classificação provisória das variedades estudadas, baseada na manifestação dos sintomas apresentados, sendo: a) susceptíveis ou sensíveis à infecção pelo vírus, exibindo os sintomas da doença, b) tolerantes à infecção, podendo ou não apresentar sintomas e c) resistentes à infecção. Esta última categoria se referiu a plantas nas quais não foram detectadas partículas virais e que não apresentaram os sintomas da doença. Dois métodos para detecção do vírus foram comparados, um serológico (DAS-ELISA) e outro molecular (RT-PCR), quando se observou que a especificidade e sensibilidade de ambos eram muito semelhantes. Em decorrência disto foi adotado então, o teste de DAS ELISA, por ser este o de maior simplicidade. A relação entre a concentração de partículas virais e a manifestação dos sintomas também foi avaliada, onde se verificou a inexistência de uma relação direta entre a primeira e a segunda. Um estudo complementar a este foi feito, para determinar a concentração de partículas virais em duas partes da folha, separando-se a nervura principal da lâmina foliar. O vírus foi detectado nestes tecidos através de DAS-ELISA, mostrando haver uma maior concentração na nervura, onde foram encontrados valores de absorbância até cinco vezes maiores, quando comparados com os valores de absorbância da lâmina foliar. Os teores de açúcares solúveis foram analisados e observou-se um acúmulo destes, em especial da sacarose, mas somente em folhas de plantas infectadas pelo vírus e que expressavam os sintomas da doença, sendo que em plantas sadias ou infectadas sem sintomas este acúmulo não ocorreu. Visando esclarecer em qual parte da folha ocorreu o acúmulo de açúcares, análises cromatográficas da lâmina foliar e da nervura principal também foram feitas, onde foi observado que o acúmulo ocorreu principalmente na nervura. Algumas alterações fisiológicas induzidas nas plantas pelo vírus, foram determinadas através da comparação da atividade enzimática de peroxidases, grupo de enzimas geralmente envolvido nas reações das plantas após a infecção por patógenos. Os resultados mostraram um claro aumento na atividade de peroxidases em plantas infectadas e exibindo os sintomas da doença, enquanto que as plantas sadias ou infectadas sem sintomas não diferiram entre siAbstract: A luteovirus was associated with the yellow leaf syndrome (YLS), a widespread disease of sugarcane (Saccharum sp.). The virus was named Sugarcane Yellow Leaf Virus (Sc YL V), and was identified in major sugarcane-producing areas of the world. Typical disease symptoms were reproduced when Sc YL V was transmitted by Melanaphis sacchari or Rhopalosiphum maidis from infected to healthy sugarcane, indicating that this virus is the causal agent of the YLS. The virus was only transmitted between sugarcane plants. Virions of SeYLV were 25 to 28 nm in diameter in sodium phosphotungstate at pH 5,0, had a buoyant density of 1,30 glcm3 in CS2SO4 and contained a 5,8 Kb genomic ssRNA. The capsid protein had an estimated relative molecular mass of 27 kDa and was not glycosylated. A polyclonal rabbit antiserum raised against Se YL V did not detect any of four other luteoviruses by enzyme-linked immunosorbent assay or immunosorbent electron microscopy, but in immunoblot assays, antibodies to the RPV serotype of Barley Yellow DwarfVirus detected the Sc YL V. It was conc1uded that Se YL V is a luteovirus that is biologically and serologically distinct from other members of the group and is the causal agent of the YLS of sugarcane. Levels of soluble sugars, especially sucrose, were significantly increased in the leaves of infected and symptomatic plants but never in symptomless infected ones. Two enzymes, guaiacol-peroxidase and syringaldazine-peroxidase had their activity significantly increased in plants infected by Se YL V and showing the disease symptoms. In contrast, no alterations in peroxidase activities were observed in healthy plants or in infected ones without symptomsDoutoradoDoutor em Biologia Vegeta