Caracterização bioquimica de uma lectina e determinação da estrutura primaria de um inibidor de serinoproteinases tipo Kunitz de sementes de Delonix regia(Flamboyant) : estudo in vitro da ação inseticida do inibidor

Orientadores: Sergio Marangoni, Maria Ligoa Rodrigues MacedoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Os objetivos deste trabalho foram purificar e caracterizar bioquimicamente uma lectina e determinar a estrutura primária de um inibidor de serinoproteinases tipo Kunitz de sementes da espécie D. regia (Leguminosae-Caesalpinioideae) e também verificar o efeito in vitro do inibidor sobre a atividade das enzimas digestivas dos insetos lepidópteros A. kuehniella e C. cephalonica. Para a purificação da lectina e do inibidor de serinoproteinases, as sementes foram trituradas e a farinha foi submetida a uma extração salina 10%. Após centrifugação, o sobrenadante (extrato total) foi dialisado, liofilizado e aplicado em colunas de exclusão molecular, troca iônica e coluna de fase reversa C18 em sistema de HPLC. As frações eluídas foram monitoradas a 280 nm de absorbância. A lectina e o inibidor purificados foram designados como DRL (Delonix regia lectin) e DrTI (Delonix regia trypsin inhibitor), respectivamente. Após a identificação e purificação, a lectina foi analisada em SDS-PAGE 12,5%, revelando que esta proteína tem massa molecular aparente de 12 kDa sob condições redutoras (DTT 0,1 M) e não redutoras. O gel nativo revelou que DRL é uma proteína constituída por apenas uma cadeia polipeptídica. Os testes de inibição da atividade hemaglutinante foram realizados com eritrócitos de ratos, utilizando-se os seguintes açúcares: D-glicose, D-glicosamina, D-frutose, D-manose, D-sacarose, D-galactose, D-galactosamina, D-rafinose, Dlactose e D-maltose e verificamos que a atividade hemaglutinante de DRL foi inibida mais especificamente por glicose a uma concentração de 0,048 mM, indicando que esta lectina pertence ao grupo glicose-manose. A composição de aminoácidos da lectina mostrou alto conteúdo de ácido aspártico, ácido glutâmico e glicina, mas nenhum resíduo de cisteína foi observado. A determinação da região N-terminal da lectina revelou alta homologia com outras lectinas de leguminosas tais como, con A, lentilha e ervilha. A faixa de pH para a atividade da lectina foi de 8-9 com perda total da sua atividade em faixa de pH ácido (2-4). Além disso, a lectina manteve sua atividade após tratamento térmico a 70°C, durante 30 minutos, com perda de 50% de sua atividade a 100°C. DRL não necessitou de cálcio para sua atividade, mas é dependente de manganês, sugerindo que DRL é uma metaloproteína. O tratamento de DRL com uréia resultou em perda total da AHE, enquanto que na presença do DTT, a lectina manteve sua atividade normal provavelmente devido à ausência de pontes dissulfeto na molécula. A determinação da estrutura primária do DrTI, comprovou que este inibidor pertence à família Kunitz de inibidores de proteinases. A região do sítio reativo possui um resíduo de ácido glutâmico ao invés de arginina ou lisina, mas a molécula apresentou dois "Ioops" compostos por quatro resíduos de cisteína com alta similaridade com outros inibidores tipo Kunitz. Os estudos de inibição in vitro mostraram que, numa concentração de apenas 5J.lg, o DrTI inibiu cerca de 92% da atividade das proteases dos insetos A. kuehniella e C. cepha/onica, indicando alta afinidade do inibidor por estas enzimas. A digestibilidade in vitro do DrTI pelas proteases dos insetos foi analisada em SDS-PAGE 12,5% e revelou que o inibidor foi resistente à proteólise após 72h. Entretanto, a incubação do DrTI com a tripsina bovina resultou em clivagem nos primeiros 30 minutos de reação. A atividade residual máxima do inibidor, após estes ensaios de digestibilidade pelas proteases de A. kuehniella, C. cephalonica e tripsina bovina foi de 69,5%, 64,9% e 34,57%, respectivamenteAbstract: The aims of this work were to purify and to characterize biochemically a lectin and to determine the primary structure of a Kunitz-type serineproteinase inhibitor from seeds of Delonix regia specie (Leguminosae-Caesalpinioideae) and also to verify the in vitro effect of the inhibitor towards to digestive enzymes activities of the lepidoptera insects A. kuehniella and C. cephalonica. For lectin and serine proteinase inhibitor purification, the seeds were tritured and the flour was submitted to saline extraction 10%. After centrifugation , the supernatant (total extract) was dialised, Iyophylized and applied in molecular exclusion, ion exchange and reverse phase C18 HPLC columns. The eluted fractions were monitored by absorbance at 280 nm. The lectin and the inhibitor purified were designated DRL (Delonix regia lectin) and DrTI (Delonix regia trypsin inhibitor), respectively. After identification and purification, the lectin was analyzed in SDS-PAGE 12.5%, showing that this protein has an apparent molecular mass of 12 kDa under reduced (DTT 0.1 M) and non reduced conditions. Analysis of native gel revealed that DRL is a protein constituted by only one polypeptide chain. The inhibition tests of hemagglutinating activity were realized with rat erytrocytes, using the following sugars: D-glucose, D-glucosamine, D-fructose, Dmannose, D-sucrose, D-galactose, D-galactosamine, D-raffinose, D-Iactose and Dmaltose and we verified that hemagglutinating activity of DRL was more specifically inhibited by glucose at 0.048 mM concentration, indicating this lectin belongs to the glucose-mannose group. The lectin aminoacid composition showed high content of aspartic acid, glutamic acid and glycine, but cysteine residue was not detected. The determination of the N-terminal region of the lectin revealed high homology with other leguminous lectins such as, con A, lentil and pea. The pH range for the lectin activity was 8-9 and DRL lost activity totally in range of acid pH (2-4). Furthermore, the lectin maintained activity after thermal treatment to 70°C, during 30 minutes, with lost of 50% in activity at 100°C. DRL does not require calcium for the activity but is manganese dependent, suggesting that DRL is a metalloprotein. The treatment of DRL with urea resulted in total lost of hemagglutinating activity, while in the presence of DTT, the lectin maintained normal activity probably due absence disulfide bridges in the molecule. The primary structure determination of DrTI, proved that this inhibitor belongs to the Kunitz family of proteinase inhibitors. The region of reactive site presented a glutamic acid residue instead of an arginine or Iysine, but the molecule presented two "loops", composed by four cysteine residues, with high similarity with other Kunitz type inhibitors. The in vitro inhibition studies with insect proteases from A. kuehniella and C. cephalonica showed at concentration of only 5mg, DrTI inhibited about of 92% of the proteases these insects, indicating high affinity of the inhibitor by these enzymes. In vitro digestibility of DrTI by insect proteases was analyzed in SDS-PAGE 12.5% and revealed that the inhibitor was resistant to the proteolysis after 72h. However, the incubation of DrTI with bovine trypsin resulted in cleavage in the first 30 minutes of reaction. The maximal residual activity of the inhibitor, after these digestibility assays by proteases from A. kuehniella, C. cephalonica and bovine trypsin was 69.5%, 64.9% and 34.57%, respectivelyDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula