Estudo da superexpressão da triparedoxina peroxidase em Trypanosoma cruzi epimastigotas

Orientador: Fernanda Ramos GadelhaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O Trypanosoma cruzi (T cruzi) está exposto a espécies reativas de oxigênio (EROs) produzidas pelo sistema imunológico do hospedeiro, assim como pelo metabolismo de drogas e pelo seu próprio metabolismo. Este parasita apresenta uma capacidade limitada em lidar com esse estresse oxidativo, sendo esta área de grande interesse para fins terapêuticos. Uma cascata enzimática para detoxificação de hidroperóxidos foi descrita para T cruzi, sendo diferente de qualquer sistema análogo no organismo hospedeiro. O estudo deste sistema e das enzimas envolvidas, incluindo a triparedoxina peroxidase (TXNPx), poderão levar ao desenvolvimento de agentes tripanossomicidas mais específicos e portanto menos tóxicos para o hospedeiro. Este trabalho explorou o comportamento de células de Tcruzi mutantes que possuem o gene da TXNPx citosólica superexpresso. Observou-se um grande aumento de rnRNA (158%) para as células transformadas com o vetor pTEX-TXNPx, sem o acompanhamento do aumento de produção da proteína TXNPx, evidenciado por Westem blotting. Possivelmente a regulação da expressão deste gene deve ocorrer a nível pós transcricional, como na maioria dos genes em tripanossomatídeos. Quando as células que superexpressam a TXNPx foram tratadas com peróxido de hidrogênio (H2O2) durante 30 min, observou-se um grande aumento dos níveis de rnRNA, mas a quantidade de proteína traduzida não aumentou na mesma proporção. Altos níveis de rnRNA correlacionados aos níveis de proteína, foram observados em períodos de incubação maiores (1h - 2hs), demonstrando que a proteína é traduzida de acordo com a necessidade do parasita. As células que superexpressam a TXNPx apresentaram um maior índice de crescimento, menor tempo de duplicação e uma maior resistência ao estresse oxidativo gerado pelo H2O2 (50% de inibição do crescimento foi alcançada com 104JlM para as células selvagens e 125JlM para as células mutantes). A superexpressão de uma única proteína da cascata de detoxificação de hidroperóxidos dos tripanossomatídeos, neste caso a TXNPx, leva a um aumento na produção de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzida (NADPH) (aproximadamente 23%). A enzima responsável por este efeito, foi a glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PD), primeira enzima da Via das Pentoses Fosfato, que produz NADPH. Assim, como para as células de mamíferos existe uma correlação entre a atividade aumentada da G6PD e a proliferação, o mesmo pode ocorrer para o T. cruzi, uma vez que as células que superexpressam a TXNPx citosólica apresentaram um índice de crescimento maior, provavelmente devido a uma maior atividade da G6PDAbstract: Trypanosoma cruzi (T cruzi) is exposed to reactive oxigen species (ROS) produced by the host immunological system, drugs metabolism and :/iom its own metabolismo This parasite has a limited capacity to cope with oxidative stress, which is of great interest to terapeutic. A hydroperoxide detoxification cascade, different :/iom any similar system in the host organism, was described for Tcruzi. The study of this system and the involved enzymes, inc1uding tryparedoxin peroxidase (TXNPx), can lead to the development of more specific trypanosomicid agents less toxic to the host. This work explored the behavior of T cruzi mutant cells, that have the cytosolic TXNPx gene overexpressed. It was observed a great increase on mRNA (158%) levels in pTEX-TXNPx transformed cells, without going along with the same increase on TXNPx protein production, as detected by Westem blotting. This result could be explained by the regulation at the post-transcriptionallevel of this gene, as the majority of trypanosomatids genes. When TXNPx overexpressed cells were treated with hydrogen peroxide (HzOz) for 30 min, a great increase on mRNA levels was observed, but protein translation did not increase at the saroe proportion. Higher mRNA levels correlated to protein levels were observed when the incubation period was longer (lh -2hs), inferring that protein translation occurs according to the parasite needs. Cells that overexpress TXNPx had a greater growing index, a smaller duplication time and a higher resistance to oxidative stress generated by HzOz (50 % of growth inhibtion was achieved at 1O4/lM for wild type and 125/lM for mutant celIs). The overexpression of on1y one protein :/iom the trypanosomatid hydroperoxide detoxification cascade, in this case TXNPx, led to an increase in reduced nicotinamide adenine dinuc1eotide phosphate (NADPH) production (23% approximately). The enzyme responsible for this effect, was glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), the first enzyme of the Pentose Phosphate Pathway, that produces NADPH. Once in mammalian celIs there is a correlation between increased G6PD activity and proliferation, the same could occur in T. cruzi since the celIs that overexpress TXNPx had a greater growth indexMestradoBioquimicaMestre em Biologia Funcional e Molecula