Caracterização molecular do Sugarcane yellow leaf virus, desenvolvimento de um metodo de diagnostico altamente sensivel e aspectos moleculares da interação luteovirus/vetor

Orientador: Jorge VegaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O vírus do amarelecimento foliar da cana-de-açúcar, Sugarcane yellow leaf vírus (ScYL V) constitui atualmente um grande problema nos principais países produtores de cana-de-açúcar. Este vírus possui diversas características físicas e biológicas, como tamanho e morfologia da partícula, reações serológicas, alterações morfológicas no hospedeiro e aspectos de transmissão, comuns aos membros da família Luteovírídae. As informações da sequência genõmica do isolado brasileiro obtidas nesse trabalho, referentes às regiões codificantes para capa protéica do vírus (CP), proteína de movimento (17 kOa ou MP) e parte da RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), mostram um alto grau de identidade e similaridade de aminoácidos com sequências de luteovirus conhecidos. Isso permite estabelecer o ScYLV como um membro definitivo da família Luteovíridae. Análises filogenéticas empregando as sequências deduzidas de aminoácidos da CP e da região C-terminal da RdRp do ScYL V sugerem diferentes afinidades taxonõmicas desse vírus dentro da família Luteovírídae, de maneira similar ao que acontece com o Soybean dwarf vírus (SOV). Análises comparativas de seqüência entre o isolado brasileiro e um isolado norte-americano revelaram diferenças de apenas dois nucleotídeos nas posições 4201(G por T) e 4232 (A por C) do genoma do ScYLV, correspondentesrespectivamente à região codificadora da proteína P17 e CP. Os dados de seqüência obtidos neste trabalho foram usados no desenvolvimento de um método sensível de diagnóstico baseado na combinação da técnica de amplificação isotérmica de ácidos nucléicos NASBA (nucleic acid sequence based amplification) e "molecular beacons", denominado AmpliOet RNA. Esse sistema de detecção foi altamente específico e ofereceu uma sensibilidade de aproximadamente 100 fg de vírus purificado, permitindo a detecção em plantas com baixos níveis de infecção viral e em um único pulgão virulífero. Os membros da família Luteoviridae são transmitidos por afídeos de uma maneira circulativa e não-propagativa. Após a aquisição, o vírus permanece no corpo do inseto por várias semanas, graças a associação com a proteína GroEL, produzida por um endossimbionte primário do pulgão. As partículas de vírus purificadas apresentam dois tipos de proteína, a proteína principal da capa protéica de 22 kDa e menores quantidades de outro componente do capsídeo, a proteína de transleitura ou "readthrough" (RTD) de 54 kDa. A protéina RTD contém determinantes responsáveis pela transmissão e acúmulo do vírus em plantas agroinfectadas. O Potato leafroll vírus (PLRV) é uma espécie do gênero Polerovirus dentro da família /,..uteoviridae. Clones infectivos de cDNA do PLRV e um mutante deletério da proteína RTD foram usados para estudar as interações moleculares entre esse luteoviruse seu afídeo vetor Myzus persicae. O mutante do PLRV, no qual a proteína RTD estava inteiramente ausente, não foi transmissível por M. persicae e não se ligou a proteína GroEL. Adicionalmente, esse mutante mostrou-se significativamente menos persistente na hemolinfa do afídeo do que as partículas não modificadas do vírusAbstract: Sugarcane yellow leaf vírus (ScYL V) is widely distributed in Brazil and other sugarcane producing countries causing significant yield losses. This virus shares biological features typical of the luteovirids. Comparisons of the coat protein (CP), 17 kDa protein and C-terminus of the RNA-dependent RNA polymerase coding regions showed that the deduced amino acid sequences of the Brazilian isolate share a considerable degree of identity and similarity with corresponding sequences of known luteovirids, thus clearly establishing ScYL V as a member of the family Luteovíridae. Phylogenetic analyses also suggest that the 5' and 3' coding blocks of the ScYLV genome possess different taxonomic affinities within the Luteovíridae family, as for the genome of Soybean dwarf vírus (SDV). Our results were published simultaneously as the sequence of a North American strain of ScYL V. Comparative analyses between the deduced peptides of Brazilian and North American strains revealed two nucleotide substitutions at positions 4201 (G_ T) and 4232 (A_C) of the ScYLV genome, corresponding to P17 and CP proteins coding regions, respectively. Our sequence data were used to develop a highly sensitive detection method based on the combination of isothermic nucleic acid sequence based amplification (NASBA) and molecular beacons, named AmpliDet RNA. This system offered a sensitivity of about 100 fg of purified virus and could detect ScYL V in plant samples with low virus titer and in one single aphid. Members in the Luteovírídae are transmitted by aphids in a circulative, nonreplicative manner. After acquisiton, luteovirus particles persist in the aphid's hemolymph for several weeks in association with a GroEL homolog, produced by the primary endosymbiont of the aphid. Luteovirus purified particles contain two types of proteins; a major 22 kDa coat protein (CP) and the minor capsid component of 54 kDa, the readthrough protein (RTD). The RTD contains determinants responsible for virus transmission and accumulation in agroinfected plants. Potato leafroll virus (PLRV) is a member of the genus Po/erovírus in the family Luteovíridae. An infectious cDNA fuI! length clone of PLRV and a mutant devoid of the RTD were used to study and better understanding the molecular interactions between this luteovirus and its aphid vector Myzus persícae. The PLRV mutant lacking the entire RTD protein was not transmissible by M. persícae and did not bind to Buchnera GroEL. Furthermore, the mutant was significantly less persistent in the aphid's hemolymph than the wild type virus. These data corroborate previous observations with Beet westem yellow vírus (BWYV) and Bar/ey ye//ow dwarf vírus (BYDV) that the RTD domain is involvedin luteovirus transmission and persistence in the aphid's bodyDoutoradoDoutor em Biologia Vegeta