Participação do oxido nitrico no desenvolvimento da encefalomielite alergica experimental em ratos

Orientador : Benedito de Oliveira FilhoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: o óxido nítrico (NO) é um radical livre produzido endogenamente a partir da oxidação de um dos nitrogênios do grupo guanidino terminal do aminoácido L-arginina por oxigênio molecular. Essa biossíntese é catalisada por uma família de enzimas denominadas óxido nítrico sintases (NOS), as quais podem ser inibidas por análogos estruturais da L-arginina que possuem grupos substituintes no grupo guanidino terminal. O NO tem significativa reatividade com espécies químicas diversas tais como oxigênio, ânion superóxido, grupos tióis, metais de transição, etc; sendo que os íons nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-) são os produtos finais estáveis da oxidação do NO no entorno fisiológico. NO, e espécies reativas derivadas do nitrogênio (NDRS) em geral, participam de vários processos fisiológicos no cérebro, incluindo neurotransmissão, neuromodulação e plasticidade sináptica, assim como de processos patológicos tais como neurodegeneração e neuroinflamação. Altos níveis de NO têm sido associados com a atividade da encefalomielite alérgica experimental (EAE), modelo empregado amplamente em animais para o estudo da esclerose múltipla em humanos. Neste trabalho, nós caracterizamos a atividade e a expressão das isoformas das NOS, bem como a presença de resíduos protéicos de nitrotirosina (NT, como indicador da produção de peroxinitrito) em massa encefálica total (MET) de ratos Lewis durante o desenvolvimento da EAE. A EAE foi induzida em ratos Lewis através da administração subcutânea de uma emulsão contendo proteína básica de mielina (MBP) e a evolução clínica da doença (estágios Q - 111) foi avaliada diariamente. No final de cada estágio, as METs foram removidas, e análises da atividade de NOS, expressão de proteínas contendo resíduos de NT, e conteúdo de mRNA para as diferentes isoformas de NOS foram realizadas. Amostras de sangue também foram coletadas para a medida dos ânions NO2- e NO3- no soro, como índice da produção de NO sistêmico. Na falta de adição de qualquer cofator exógeno de NOS (exceção feita para o NADPH), a atividade de NOS dependente de Ca2+ foi significativamente diminuída nos ratos com EAE-III quando comparada com as dos grupos controle, EAE-Q ou EAE-I, mas nenhuma diferença foi observada entre os grupos na atividade de NOS independente de Ca2+. Por outro lado, quando os cofatores calmodulina (CaM), FAD, tetrahidrobiopterina (BH4) e NADPH foram adicionados, nenhuma diferença na atividade de NOS dependente de Ca2+ foi observada entre os grupos controle e EAE-III. Uma diminuição similar também foi observada na atividade de NOS dependente de Ca2+ dos grupos controle e EAE-III quando o FAD foi omitido do meio de incubação, mas nenhuma alteração ocorreu na ausência dos outros cofatores. Um aumento não significativo foi observado na atividade de NOS independente de Ca2+ da MET de ratos com EAE-II I quando comparada à atividade obtida pelo grupo controle na presença de todos os cofatores. A atividade de NOS independente de Ca2+ de ratos com EAE-III não foi afetada pela omissão de qualquer um dos cofatores adicionados, enquanto que a do grupo controle foi inibida significativamente tanto pela ausência de FAD como de BH4 no meio de incubação. A análise por RT-PCR não revelou qualquer alteração significativa no mRNA das isoformas nNOS ou eNOS entre os grupos experimentais; contudo, níveis aumentados de mRNA para iNOS foram detectados em homogenatos de MET de ratos com EAE-III em comparação com os animais controle. A análise de proteínas contendo resíduos de NT por Western blot mostrou um aumento significativo na intensidade de duas bandas (pesos moleculares 53 e 28 kDa) nos grupos EAE-II e EAE-III em comparação com o grupo controle. Os níveis de N03- sérico foram encontrados significativamente mais altos nos ratos com EAE 111 do que nos animais controle. Homogenatos de MET ou soro de animais controle mostraram sobre a atividade de NOS exacerbado efeito inibitório quando comparado àquele observado para homogenatos de MET ou soro de animais com EAE-III. No entanto, as diferenças entre os grupos desaparecem após desnaturação por aquecimento (tanto dos homogenatos de MET como dos soros). Com base nesses resultados, nós concluímos que paralelo a uma diminuição da atividade de NOS dependente de Ca2+, um aumento da expressão ("up-regulation") de iNOS ocorre durante estágios mais avançados da doença, o qual poderia ser responsável pelo aumento da produção de NO sistêmico observado e ao aparecimento de proteínas modificadas por nitração de resíduos de tirosina a nível de sistema nervoso central. Por outro lado, a diminuição da sensibilidade de iNOS para ambos FAD e BH4, e a ausência de inibidor circulante termolábil de NOS observado em animais com EAE reflete uma complexa modulação da atividade de NOS nos diferentes níveis de sítios regulatórios nesse modelo animal de esclerose múltiplaAbstract: Nitric oxide (NO) is a free radical endogenously synthetised by oxidation of one of the guanidinum nitrogen atoms of the aminoacid L-arginine by molecular oxygen. This biosynthesis is catalised by a family of enzimes generically known as nitric oxide synthases (NOS), which can be inhibited by structural analogs of L-arginine having substituent groups at the terminal guanidinum moeity. NO is extremely reactive toward different chemical species such as oxyigen, superoxide anion, thiol groups, transition metal ions, etc; nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) anions are the stable end products which result from NO oxidation within the physiological environment. NO, and nitrogen-derived reactive species (NDRS) as a whole, take part of several physiological processes in the brain, including neurotransmision, neuromodulation and synaptic plasticity, as well as pathological processes such as neurodegenerative diseases and neuroinflammation. Increased nitric oxide (NO) production has been associated with disease activity in experimental allergic encephalomyelitis (EAE). In this study, we characterized the expression and activity of the different NOS isoforms, as well as the presence of protein nitrotyrosine residues (NT, as a marker of peroxynitrite production) in whole encephalic mass homogenates during the development of EAE in rats. EAE was induced in Lewis rats by subcutaneous injection of an emulsion containing myelin basic protein and the development of the disease (stages Q - 111) was clinically evaluated daily. In the end of the different stages, whole encephalic masses (WEM) were removed for further analysis of NOS activity, protein NT residues (Western blot) and mRNA for the different NOS isoforms (RT-PCR). Blood samples were also collected for measurement of serum NO2- and NO3- as an index of systemic NO production. In the absence of the addition of any exogenous NOS cofactor (with the exception made for NADPH), Ca2+-dependent NOS activity was significantly decreased in rats with EAE at stage 111 when compared with either control, EAE-Q ar EAE-I groups, but no differences in Ca2+-independent NOS activity were observed among the groups. In the other hand, when the cofactors calmodulin (CaM), FAD, tetrahydrobiopterin (BH4) and NADPH were exogenously added, no differences in WEM Ca2+-dependent NOS activity were observed between control and EAE III groups. Similar decreases in Ca2+dependent NOS from either control or EAE 111 rats were observed when FAD was omitted from the incubation media, but no changes occurred in the absence of the other cofactors. A non-significant increase in Ca2+ -independent NOS activity was observed in WEM from EAE 111 rats compared to those from control animais in the presence of ali the cofactors. Ca2+ -independent NOS activity in WEM homogenates from EAE III rats was not affected by the omission of any of the added cofactors, while the one from control animais was significantly inhibited by the absence of either FAD or BH4 in the incubation media. RT-PCR analysis revealed no significant changes in either nNOS or eNOS mRNA among the groups of rats; however, increased levels of iNOS mRNA were detected in WEM homogenates from EAE 111 in comparison with those from control animais. Western blotting of NT-containing proteins showed two major bands (MW: 53 and 28 kDa) of significantly increased intensity at both stages 11 and 111 in comparison with controls. Serum NO3- levels were found significantly higher in EAE 111 rats than in control animais. The addition of either WEM homogenates or sera from control animais to a NOS preparation led to an exacerbated enzyme inhibition than that observed with WEM homogenates or sera obtained from EAE 111 rats. However, differences between groups disappear after heat-denaturation of both the WEM homogenates and sera. Based on these results we conclude that parallel to a decrease of constitutive Ca2+dependent NOS activity, up-regulation of iNOS occurs during advanced EAE stages, which could be responsible for the observed increase in systemic NO production and the appearance of NT-modified proteins at the CNS leveI. On the other hand, the decreased sensitivity of iNOS to both FAD and BH4, and the absence of a thermolabile circulating NOS inhibitor observed in animais with EAE reflect a complex modulation of NOS activity at different regulatory site levels in this animal model of multiple sclerosisDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula