Estudo da interação da veratrina com o musculo esqueletico por metodos histoquimicos, ultraestruturais e bioquimicos

Orientador: Maria Alice da Cruz-HoflingDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A veratrina é o extrato comercial obtido do Schoenocaulon officinale (Liliaceae), planta nativa da América do Sul e Central, que ativa os canais de sódio-voltagem dependentes, induzindo despolarização persistente e aumento da permeabilidade aos íons sódio em fibras musculares ou nervosas. O objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos da veratrina sobre o músculo esquelético de camundongos e peixes. A expressão fenotípica das fibras oxidativas, oxidativa-glicolíticas e glicolíticas no músculo sóleo (de contração lenta, com fibras predominantemente oxidativas) e EDL (de contração rápida, com maioria de fibras glicolíticas) de camundongos, e do músculo lateral de tilápia foi examinada em vários intervalos de tempo após injeção intramuscular da veratrina. As alterações ultraestruturais nos músculos foram analisadas ao microscópio eletrônico de transmissão. Os efeitos da veratrina foram também examinados em mitocôndrias isoladas de músculo esquelético de camundongos e ratos, e em mitocôndrias de fígado de ratos. Nos camundongos, as fibras oxidativas e as fibras oxidativa-glicolíticas, ambas ricas em mitocôndrias, mostraram um decréscimo da atividade das enzimas oxidativas (NADH TR) após a veratrina. As fibras glicolíticas, com menor número de mitocôndrias foram menos sensíveis ao alcalóide. Já nas tilápias, foram as fibras oxidativas e as glicolíticas que apresentaram maior susceptibilidade ao dano metabólico sob ação do alcalóide. Com relação à atividade contrátil houve um significante decréscimo (P=O.OOl) no número de fibras tipo IIB e um aumento no número de fibras tipo I de camundongos após injeção do alcalóide no EDL. Ao contrário, no músculo sóleo houve um decréscimo nas fibras tipo I e IIA. Além disso, houve o aparecimento de fibras indiferenciadas nos dois músculos ao longo dos 60 nrin do tratamento. Em contraposição, não houve alterações na atividade contrátil dos três tipos de fibras presentes no músculo lateral das tilápias ao longo dos 30 nrin após a adnrinistração do alcalóide, exceto pelo aparecimento de fibras indiferenciadas aos 60 min. As alterações mionecróticas produzidas pela veratrina incluíram dilatação das cisternas ternrinais do retículo sarcoplasmático, hipercontração de miofibrilas, desorganização de sarcômeros, dissociação e/ou ruptura de miofilamentos e dano mitocondrial. Estas alterações se diferenciaram quanto à gravidade e ao tempo de aparecimento nos diferentes músculos. Por exemplo, a dilatação das cisternas do retículo sarcoplasmático ocorreu mais precocemente e foi mais evidenciada nas fibras musculares do EDL do que no sóleo, ao passo que foram sutis nas fibras das tilápias. As alterações mitocondriais entretanto, foram mais precoces e proenrinentes no sóleo do que no EDL. Os efeitos da veratrina nas mitocôndrias isoladas mostraram que o alcalóide desacopla a oxidação fosforilativa em músculos esqueléticos de camundongos e ratos, devido a um aumento na transição da permeabilidade da membrana interna a protóns, de modo não específico. Diferentemente, a atividade respiratória nas mitocôndrias isoladas de figado foi inibida após a adnrinistração da veratrina. Nós concluímos que a interação da veratrina com as fibras musculares é espécie específica, músculo-específica e tipo de fibra específica, e que a interação da veratrina com as mitocôndrias é tecido(órgão )-específica. As alterações mionecróticas induzidas pela 11- veratrina foram atribuídas ao maior influxo de íons sódio e de água para o interior das células, já que estes efeitos foram antagonizados pela tetrodotoxina, um bloqueador de canais de sódio. Entretanto, não podemos descartar a possibilidade de que outros mecanismos, tais como a mobilização de Ca2+ das cisternas do retículo sarcoplasmático ou de mitocôndrias e/ou a penetração da toxina para o interior das células possam estar envolvidosAbstract: Veratrine, a commercial extract from the South and Central America plant Schoenocaulon officinale (Liliaceae), activates voltage-dependent Na + channels to produce persistent depolarization and an increase in sodium ion penneability in muscle fibers or nerves. The aim of this study was to investigate the effects of the veratrine aIkaloid on skeletal muscle of mice and fish. The phenotypic expression of oxidative, oxidative glycolytic and glycolytic fibers in soleus muscle (slow-twitch, with predominant1y oxidative fibers) and EDL muscle (fast-twitch, with predominant1y glycolytic fibers) of mice, and lateral muscle of tilapia were examined at various times afier intramuscular injection of veratrine. The ultrastructural changes in the muscles were analyzed by transmission electron microscoy. The veratrine effects were also examined in isolated mitochondria from mice and rats skeletal muscle, and in isolated rat liver mitochondria. In mice, oxidative and oxidative-glycolytic fibers, which are rich in mitochondria, showed decreased oxidative enzyme activity (NADH-TR reaction) afier veratrine. Glycolytic fibers, which have fewer number of mitochondria, were less sensitive to the aIkaloid. However, the oxida tive and glycolytic fibers of tilapia were more susceptible to damage by veratrine. There was a significant decrease (P=0.001) in the number oftype IIB fibers and an increase in the number of type I fibers in EDL muscle of mice (m-ATPase reaction) afier aIkaloid injection. In contrast, there was a decrease in type I and lIA fibers of the soleus muscle. Moreover, undifferentiated fibers were present in both muscles throughout the 60 min treatment. Contrarily, there were not alterations in the contractile activity of the three types of fibers present in tilapia lateral muscle up to 30 min afier aIkaloid injection, but undifferentiated fibers were seen afier 60 minutes. The myonecrotic alterations produced by veratrine included swelling of the terminal cisternae sarcoplasmic reticulum, hypercontraction of myofibrils, disorganization of sarcomeres, dissociation and/or rupture of myofilaments and mitochondrial" damage. These alterations differed in gravity and duration in different muscles. Thus, swelling of the sarcoplasmic reticulum cisternae was earlier and more prominent in EDL muscle fibers than in the soleus, and was subtle in tilapia muscle fibers. The mitochondrial alterations though were earlier and more prominent in the soleus than in the EDL. The effects of veratrine in isolated mitochondria showed that the aIkaloid uncouples oxidative phosphorylation in mice and rats skeletal muscle due to an increase in unspecific permeability transition of the inner membrane to protons. Differently, the respiratory activity on isolated liver mitochondria was inhibited afier veratrine administration. We conclude that the interaction of veratrine with muscle fibers is species-specific, muscle-specific and fiber type-specific, and that the interaction of the veratrine with mitochondrial is tissue( organ)-specific. The veratrine induced-myonecrotic alterations were attributed to the higher influx ofNa+ ions and water into cells, since they were antagonized by tetrodotoxin, a Na+ channel blocker. However, the involvement of other mechanisms, such as the mobilization of calcium ions from sarcoplasmic reticulum cisternae or mitochondria, and/or the entry oftoxin into cells cannot be ruled outMestradoBiologia CelularMestre em Biologia Celular e Estrutura