Determinação das regiões de recombinação em haplotipos atipicos de pacientes com anemia falciforme

Orientador: Fernando Ferreira CostaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: O complexo da globina beta humana compreende uma região de 70 kb e contém numerosos polimorfismos. O conjunto desses polimorfismos está em desequilíbrio de ligação com o gene da globina 'beta POT. S' e são denominados de haplótipos. O estudo desses haplótipos mostrou que a mutação da globina 'beta POT. S' teve origens independentes em diferentes regiões. Essas regiões dão a denominação aos haplótipos, desta forma os haplótipos clássicos são Bantu, Benin, Senegal, Camarões e Indiano. Nesse estudo foram caracterizados, do ponto de vista molecular, 13 pacientes que apresentaram haplótipos atípicos. Este estudo possibilitou a caracterização desses haplótipos e, nos casos de recombinação, permitiu identificar a região do provável ponto de quebra. Os haplótipos foram determinados pela análise dos seguintes sítios para RFLP: XMn I - 5' gene 'gama G', Hind III- 'psi G' e 'psi A', Hinc II - 'psi beta', Hinf I - 5' 'beta' e Ava II - 'beta'. Adicionalmente, foram selecionadas 3 regiões de repetições de dinucleotídeos, ao longo do "cluster" da globina beta - no interior do LCR-HS2 (repetição de TA), entre o LCR e o gene 'epsilon' (repetição CA) e no interior, do segundo intron do gene 'gama G' (repetição TG). Essas regiões foram analisadas por PCR radioativo e observadas em gel de poliacrilamida desnaturante. Regiões microsatélites são comumente usadas como marcadores polimórficos, porém seu papel funcional é fracamente documentado. Além disso, foram estudadas outras seqüências: 3 localizadas em uma região de 8 kb entre LCR-HS2 e o gene 'epsilon'; uma localizada 5' do gene 'beta' e outra localizada 3' do gene 'beta', no sítio hipersensível 3' (HS3'), por SSCP não radioativo. Foram também caracterizadas por sequenciamento a região de repetição localizada entre LCR e o gene 'epsilon' (repetição CA) e também uma região de repetição localizada na posição ¿530 5' do gene 'beta'- (AT)xTy. Em 8 dos 13 alelos analisados, o ponto de quebra da recombinação ocorreu dentro de uma região de 2 kb entre LCR e gene 'epsilon' - 7 alelos revelaram. um haplótipo híbrido Bantu/Benin e 1 revelou o híbrido Bantu/Senegal. Em 3 outros casos nós observamos dois pontos de quebra no mesmo alelo - um localizado dentro de uma região de 2 kb entre LCR e o gene 'epsilon' e o segundo localizado entre os genes 'delta' e 'beta'. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digitalAbstract: Human beta globin gene complex spans a region of 70 kb and contains numerous sequence variants. Alleles within the cluster of polymorphic sites stretching from 5' of the 'epsilon'-globin gene to 3' of 'psi' 'beta'-globin gene show strong linkage disequilibrium; similar linkage disequilibrium exists for the alleles in the cluster of sites from 5'of the 'beta' globin gene to 17 kb downstream. No linkage disequilibrium exists between these two subclusters. The 9 kb region between the 5' and 3' clusters has therefore been proposed as a recombination "hot-spot". This study intends to investigate if the length of the repeats is haplotype specific and to narrow the 'beta' globin cluster in order to characterize the most approximate breakpoint. We described 13 sickle cell patients with at least one recombinant allele. 'Beta' haplotypes were derived from the following RFLPs in the 'beta¿ globin gene cluster: XMn I - 5' 'gama SOB. G', Hind III - 'gama SOB. G' and 'gama SOB. A', Hinc II -'psi' 'beta', Rinc II - 3' 'psi' 'beta', Rinf I - 5' 'beta' and Ava II 'beta'. RFLPs were analyzed using restriction enzyme analysis of DNA thât was specifically amplified by the PCR. Furthermore, we selected 3 short tandem repeats (STR) throughout the 'beta' globin cluster - within the LCR - HS2 (TA repeat), between LCR and 'epsilon' gene (CA repeat), and within the second intron (lVS2) of the 'gama SOB. G' (TG repeat). These sequences were analyzed by radiolabeled PCR and observed in denaturing polyacrilamide gel. These microsatellites are commonly used as polymorphic markers but their potential functional role is poorly documented. ln addition, we analyzed other sequences - three sequences located within a region of 8 kb between 'beta'LCR-HS2 (second DNase I hypersensitive site within the, beta locus control region) and 'epsilon' gene, one located 5'of the 'beta' globin gene and one located. ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertationsMestradoClinica MedicaMestre em Clinica Medic