Otimização da nested-PCR em turbo unico na detecção do RNA-HCV

Orientador: Mario Hiroyuki HirataTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: No presente estudo foi otimizado uma metodologia de nested-PCR em tubo único para a detecção do RNA-HCV. As condições da nested-PCR em tubo único foram estabelecidas utilizando um controle recombinante, produzido pela amplificação da região 5'-UTR do genoma do HCV, clonado no vetor pBluescript KS-, do qual removeu-se 72 nucleotídeos da região interna do fragmento clonado através da digestão com a enzima PpuM I. A amplificação de um único fragmento ao término da reação da nested-PCR em tubo único foi alcançado quando foram utilizadas as seguintes concentrações: 2 mM de 'MgCI IND. 2+', 5 nM e 200 nM de primers externos e internos respectivamente, e temperaturas de hibridação de 72°C e 46°C para a primeira e segunda etapas da reação. Foram utilizados 20 ciclos para a primeira etapa e 35 ciclos para a segunda etapa da reação. Ensaios de sensibilidade usando diferentes números de cópias do controle recombinante (pB-HCV-2), detectaram um mínimo de 900 cópias, que comparado com a nested-PCR convencional mostrou sensibilidade 10 vezes inferior. A diferença na sensibilidade observada entre as duas metodologias não interferiu na detecção do RNA-HCV quando amostras biológicas foram testadas. Nossos dados indicam que a nested-PCR em tubo único desenvolvida pode ser empregada para a detecção do RNA-HCV mostrando potencialidade para o uso na clínica, como um método alternativo par.a a detecção do RNA-HCVAbstract: In the present study a methodology was optimized to a nested-PCR in single tube for the detection of RNA-HCV. The sequences of primers were chosen allowing different optimum annealing temperature between the first and second PCR reaction in single tube. PCR conditions were established using an control produced by amplification of 5' NCR from genome that is highly conserved deleting 72 nucleotides with the enzyme PpuM I and cloned into pBluescript KS vector. The amplification of a single fragment at the end of a single tube reaction in the nested-PCR was reached when concentrations of 2 mM of 'MgCI. Ind 2', 5 nM and 200 nM of external and internal prímers, were used respectively. The temperature of annealing used was 72°C and 46°C for the first and second stage of the nested PCR reaction, with 20 and 35 cycle of al!lplification respectively. Sensibility tests, using different numbers of copies of the control (pB-HCV-2) were able to detect about 900 copies using our method. The conventional nested-PCR showed sensibility 10 times higher, detecting 90 copies. The difference in the sensibility observed between the two methodologies didn't interfere in the detection of RNA HCV when biological samples were tested. Our data indicated that the nested PCR in single tube developed can be used for the detection of RNA-HCV as an alternative method for the detection of RNA-HCV in clinical samplesDoutoradoDoutor em Biologia e Patologia Buco-Denta