Caracterização da enzima lisina cetoglutarato redutase (LKR)/ sacaropina desidrogenase (SDH) estudada em Phaseolus vulgaris

Orientadores: Luiz Gonzaga Santoro, Paulo ArrudaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A via de degradação da lisina em plantas é catalizada pela enzima bifuncional lisina cetoglutarato redutase (LKR) / sacaropina desidrogenase (SOH). A LKR condensa lisina e a-cetoglutarato em sacaropina usando NAOPH como cofator e a SOH converte a sacaropina em a-aminoadipato-õ-semialdeido e ácido glutâmico, usando NAO+ como cofator. No presente trabalho foi demonstrado, em Phaseo/us vu/garis, a participação desta enzima no catabolismo de lisina. A atividade foi medida em diferentes tecidos desta espécie. O hipocótilo apresentou maior atividade específica em plantas estioladas, seguidas pela folha, vagem e raiz, com valores muito inferiores. Sementes e cotilédones não demonstraram presença mensurável da enzima. A LKRlSOH também foi encontrada em plântulas de feijão carioca 80 crescidas in vitro à partir de sementes cujo cotilédone foi retirado previamente. Usando o sistema in vitro, a resposta enzimática à adição de lisina no meio de crescimento foi testada, demonstrando que o substrato não causa alterações na atividade. A precipitação de proteínas do tecido de hipocótilo em concentrações crescentes de PEG 8000 revelou dois platõs de atividade, levantando a hipótese de haver duas isoformas da enzima. Essa possibilidade foi reforçada posteriormente devido à respostas diferentes à inibidores de fosfatase, os quais revelaram que a LKRlSOH em feijão é uma fosfoproteína, assim como já foi observado em outras plantas. A enzima do hipocótilo foi isolada por métodos cromatográficos, indicando ser um polipeptídeo bifuncional. No entanto, dependendo do procedimento de purificação, a enzima pode eluir como um monõmero de 94kOa, contendo apenas a atividade da SOH, ou como um dímero de 190kOa, com ambas atividades eluindo conjuntamente. As condições de iluminação durante o crescimento da planta revelaram exercer influência na atividade da LKRlSOHAbstract: The pathway of Iysine catabolism in plants is catalyzed by the bifunctional enzyme lysine ketogltutarate reductase (LKR) /saccharopine dehydrogenase (SOH). LKR condenses lysine and "alfa" ketoglutarate into saccharopine, using NAOPH as a cofactor and SOH converts saccharopine into a-aminoadipate õ-semialdehyde and glutamic acid, using NAO+ as a cofactor. In the present work it was demonstrated, in Phaseolus vulgaris , the participation of this enzyme in lysine catabolism. The activity was measured in different tissues from this species. The hipocotyl presented the highest specific activity in etiolated plants, followed by the leaf, pod and root, with much lower values. Seeds and cotyledons did not present any measurable activity. LKRlSOH was also found in carioca 80 seedlings grown, in vitro, from seeds whose cotyledon was previously removed. Using the in vitro system, the response to Iysine in the growing medium was tested revealing that the substrate didn't result in any change in enzyme activity. The precipitation of proteins from hipocotyl tissue with increasing concentrations of PEG 8000 revealed two p/atos of enzyme activity, raising the hypothesis that two isoforms of this enzyme are present. This possibility was subsequently reinforced due to different responses to phosphatase inhibitors, which revealed that LKRlSOH in P. vulgaris is a phosphoprotein, as observed with other plants. The hipocotyl enzyme was isolated by chromatographic methods, showing it to be a bifunctional polypeptide. However, depending on the purification procedure, it may elute as a monomer of 94 kOa containing only SOH activity, or as a dimer of 190 kOa where both activities elute together. Light conditions during plant growth were shown to influence the activity of LKRlSOHDoutoradoBiologia VegetalDoutor em Ciência