Identificação, clonagem, estrutura e transcrição do loco genico mitocondrial nad3-rps12 de Coix lacryma-job L.

Orientador: Anete Pereira de SouzaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Com o objetivo de identificar e clonar um gene novo do DNA mitocondrial (DNAmt) de Coix lacryma-jobi L. (coix), utilizou-se a estratégia da hibridização heteróloga. Para tanto amplificou-se por PCR um fragmento correspondente a um quadro de leitura aberto ("open reading frame"-oif), denominado orf167, presente no DNAmt da briófita Marchantia polymorpha, e tido como um possível gene. Marcou-se radioativamente e utilizou-se esta sequência como sonda em hibridizações com o DNAmt de coix digerido com várias enzimas. Identificou-se um fragmento homólogo Bgl II/ Bgl II de 1,4 kb, o qual foi clonado em pBluescript. Elaborou-se o mapa de restrição deste fragmento e localizou-se nele a exata região de homologia com a orf167. A região de homologia estava presente em um fragmento interno de 0,5 kb Spe I / Pvu II. Este fragmento de 0,5 kb, homólogo à orf167, foi utilizado em hibridizações com o DNArmt de várias espécies de plantas superiores (alfafa, batata, coix, couve-flor, ervilha, milho e soja), verificando-se que o mesmo correspondia a uma seqüência altamente conservada. Este mesmo fragmento foi também hibridizado em membranas contendo o RNAmt tota de oix e de outras espécies de plantas superiores (milho e couve flor). Os resultados revelaram que ele é transcrito na mitocôndria das espécies analisadas. O fragmento original de 1,4 kb Bgl II / Bgl II foi divido em 5 subfragmentos, os quais foram clonados e sequenciados. Após a análise da homologia desta sequência com outras presentes nos bancos de dados, verificou-se que o fragmento de 1,4 kb Bgl II./ Bgl II, isolado do DNAmt de coix, contém um "cluster" gênico onde estão presentes o gene que codifica o tRNA serina (tRNAScr), um pseudo-gene provavelmente originado do tRNA fenilananina (tRNAPhe), os genes nad3 e rps12. Tais genes presentes em coix são muito similares àqueles presentes em trigo e milho, os quais se organizam também em um "c1uster" gênico muito similar ao existente em coix. Estudos de expressão realizados através de "Northern Blotting" e RT ¿PCR mostraram que os genes tRNA ser, nad3 e rps12 são transcritos, sendo os dois últimos cotranscritos. Vinte e três elones de cDNA dos transcritos dos genes nad3 e rps12 foram seqüenciados, e tiveram suas sequências comparadas com a seqüência genômica. Encontrou-se 21 sítios de edição nos transcritos do gene nad3 e 8 sítios nos transcritos do gene rps12. Após comparações entre a sequência de aminoácidos predita a partir do clone genômico e do cDNA, observou-se que todas as edições modificam o aminoácido especificado pelo codon onde O evento de edição foi detectado, tornando a sequência de aminoácidos editada diferente da prevista pela sequência genômica. Vinte sítios de edição no gene nad3, e 6 no gene rps12, alteram a identidade do codon, de modo a especificar um aminoácido mais conservado durante a evolução entre diferentes espécies vegetais. Os outros três sítios, sendo I no gene nad3 e 2 no gene rps12, acarretam mudanças raras, espécie-específicas e não conservativas. Todos os 23 elones de cDNA investigados estavam diferentemente editados, predominando os cDNAs com sítios parcialmente editados. Não foi encontrada nenhuma orientação preferencial (5' para 3', ou 3' para 5') para o processamento da edição. Discute-se os motivos do reconhecimento do gene nad3 de coix pela orf167 de M. polymorphaAbstract: We have cloned and sequenced the nad3 and rps12 mithocondrial genes from Coix lacryma-jobi L., whose sequence were found to be similar to the corresponding genes in wheat and maize. In addition, we have indentified a tRNA Ser and a pseudo-tRNA genes on the 5¿ upstream of nad3, generating a locus organization which is identical to what has been observed in wheat and maize. The locus identification was performed with a heterologous hibridization using the mitochondrial probe orf167 from Marchantia polymorpha. The gene expression was analysed using NoI1hern hybridization and RT -PCR, indicating that nad3 and rps12 gene were cotranscribed in a 1.3 kb RNA molecule. Concernig the RNA editing, we have found 21 and 8 sites in the nad3 and rps12 genes respectively. In general terms, the observed coix mRNA editing has changed the codon identities in such a way that the NAD3- and RPS12- protein aminoacid sequence was kept closer to the corresponding ones in other organisms. However, we have detected three specie-specific editing sites which were not conservative. As for the editing processing, we have analysed 23 cDNA clones which showed different editing pattems. A predominance of partial editing was observed where the edited sites were randomly distributed.MestradoGenetica Vegetal e MelhoramentoMestre em Genética e Biologia Molecula