Celula progenitora de sangue de cordão umbilical humano : viabilidade para reconstituir linhagem hematopoietica e terapia genica

Orientador: Sara Teresinha Olalla SaadDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Nos últimos anos, o sangue de cordão umbilical humano (scuh) vem se tornando fonte alternativa viável, para obtenção de célula precursora de linhagem hematopoiética devido à facilidade em ser obtido, manipulado e rico em células precursoras. Estas células são mais imaturas que as da medula óssea, tendo grande capacidade de proliferação, replicação e transfecção. Apresenta, quando transfectada, maior expressão do material introduzido. No intuito de estudar a viabilidade destas células para reconstituir linhagem hematopoiética, analisamos sua capacidade de proliferação em cultura em meio de metilcelulose, antes e após criopreservação e transplantando-as em camundongos portadores de imunodeficiência severa combinada (SCID), irradiados. Foram coletadas, no período de junho de 1996 a agosto de 1998, 75 bolsas de scuh. Houve uma variação no volume de sangue coletado de 1 a 120 ml com média de 57 ml. O número médio de células viáveis foi de 119 x105 /ml de sangue de cordão. Nos estudos clonogênicos as médias observadas foram 216 colônias de CFU/BFU-E, 134 colônias de CFU-GM e 22 colônias de CFU-GEMM. Durante o estudo notamos uma proliferação intensa nas culturas de sangue de cordão de prematuros quando comparados com os neonatos de termo. Os prematuros apresentaram um maior número de células precursoras viáveis (371 x 105/ ml de sangue de cordão) que os de termo (74 células. x 105/ ml de sangue de cordão) Na leitura feita no 8° dia de cultura, encontramos 284 CFU/BFU-E nos prematuros e 19 colônias nos de termo (p=0,003). Em relação às CFU-GM os prematuros apresentaram 196 colônias/ml de sangue de cordão e os de termo 15 colônias Iml (p=0,003). Foram encontradas 29 colônias de CFU-GEMMM nos prematuros e nenhuma colônia nos de termo (p=0,003) No 14° dia, os prematuros apresentaram 358 colônias de CFU/BFU-E e os de termo 216 colônias (p=0,061); 219 colônias de CFU-GM e os de termo 120 colônias (p=0,075); 41 colônias de CFU-GEMM e os de termo 23 colônias (p=0,040). Tal fato poderia estar relacionado com o maior número de células precursoras existente em prematuros que se relaciona com a ontogenia da hemopoiese. Entretanto a diferenciação nos diferentes tipos de colônia se encontra também acelerado. As culturas dos prematuros no 8° dia foram semelhantes às de termo no 14° dia, já apresentando grande quantidade de CFU-GEMM. As culturas do 14° dia já apresentavam BFU-E, as quais, só aparecem nas de termo no 21° dia, apresentando também, intensa proliferação celular, dificultando a contagem. Provavelmente as células dos prematuros analisados (idade gestacional entre 20 e 32 semanas) devem entrar em ciclo celular antes que as de termo. Este achado está sendo objeto de estudo o estudo da viabilidade das células após o congelamento demonstrou que elas permaneceram viáveis após a crio preservação, mantendo, nos estudos clonogênicos, sua capacidade proliferativa e na imunofenotipagem, a proporção de células CD34+ foi semelhante à realizada pré- congelamento. O transplante foi realizado em 20 camundongos de linhagem SCID/SCID, após terem sido irradiados com 300 rads de fonte de Césio, injetando-se 1,0 x 10 7 células mononucleares de scuh em veia orbitária. Concomitantemente, num dos experimentos foi sacrificado um animal sem ser irradiado e transplantado, sendo feita a avaliação do mesmo modo que para avaliar a pega dos transplantados. Para avaliação da pega, os camundongos foram sacrificados 8 semanas após transplante, sendo feita cultura de lavado de medula óssea dos camundongos em meio sem i-sólido de metilcelulose com fatores estimulantes de crescimento recombinantes, específicos para linhagem celular humana e análise através de imunofenotipagem por citometria de fluxo com anticorpos monoclonais para células humanas. Foram obtidas amostras de sangue periférico, macerado de pulmão, baço e de lavado de medula óssea A pega na 8a semana pós transplante ocorreu em 6 dos 21 camundongos; 15 animais morreram na 1 a semana pós, irradiação, o que pode acontecer pois a linhagem SCID é mais sensível que as outras linhagens. Houve intensa proliferação nas culturas, dificultando a contagem das CFU-C. A análise através da citometria de fluxo foi positiva em 3 dos 6 casos. Foram analisados 6.000 a 10.000 eventos. A porcentagem encontrada de células captadas pelos anticorpos foi expressa em relação ao campo de linfócitos. Foram encontradas, no sangue periférico, 400 células com 26,03% de CD45, 4,50% de CD2, 30,14% de CD3, 1,03% de CD19. No pulmão, 2500 células com 18,65% de CD45, 16,32% de CD3 e 0,37% de CD19. Na medula óssea, 1000 células, com 12,80% de CD45, 4,45% de CD3, 0,855 de CD8, 0,03% de CD34. No baço, haviam 2300 células sendo 36,84% de CD45, 28,27% de CD3, e 1,62% de CD19. No camundongo sem transplante não houve marcação para células humanas. Mediante os dados apresentados, que se relacionam com os da literatura, as células precursoras do sangue de cordão são capazes de reconstituir a linhagem hematopoiética após ablação da medula e devido às suas caracteristicas, imaturidade, grande capacidade de proliferação e autogeração podem ser adequadas para terapia gênicaAbstract: During the past 14 years, human umbilical cord blood (UCB) has become an important source of hematopoietic stem cells The collection and manipulation of UCB is easy and due to the rich content of progenitors cells, when cultured, these cells provide a high enough number of GM-CSF colonies to allow recovery of the hematopoietic lineage. UCB progenitor cells display a great ability to proliferate and self-renewal and are capable of multilineage expression in secondary colony cultures. In addition, UCB cells can be efficiently infected with retroviruses and provide a high level of expression of the introduced sequence. So, UCB cells can also be used in gene therapy. To evaluate the proliferative potential of UCB stem cells to recover hematopoietic lineage, we collected between june, 1996 to august 1998, 75 UCB bags and analyzed, before and after cryopreservation, their viability and proliferative capacity in methylcellulose culture, we also performed transplantation of these cells into SCIO mice in order to recover bone marrow after ablative irradiation. The collected volume medium was 57ml, the medium viable number of mononuclear cells was 119 x105/ml of cord blood. The medium CFU-C founded in clonogenic studies were: 216. CFU-E, 134 CFU-GM and 22 CFU-GEMM. During our study we discovered that cultures from UCB cells of premature neonates had an early growth of CFU-E/BFU-E, CFU-GM and CFU-GEMM, on the 8th day of culture, and that the number and morphological characteristics of these colonies were comparable to those from fuI! term neonates obtained on the 14th day. The prematures presented, on the 8th day of culture, 284 CFU/BFU-E while, in full term neonates there were 19 colonies (p=O,003). We found 196 CFU-GM colonies in the premature group and 15 colonies in the full term group (p=O,OO3), 27 CFU-GEMM colonies in the premature group and none in the full term group (p=O,OO3). On the 14th day of culture the results were as following: CFU/BFU-E - premature 358 x full term 216 (p=O,061), CFU-GM - premature 219 x full term 120 (p=O,075) and CFU-GEMM - premature 41 x fuIl term 23 (p=0,040). These results indicated that premature UCB cells have a higher proliferative potential, this capacity may not be only related to their higher concentration of primitive hematopoietic progenitor cells, but rather to a different timing to entry into the cell cycle. The study about cryopreservation demonstrated that the viability and clonogenic results were comparable with the results before cryopreservation. In order to evatuate the viabiity of UCB cells to recover hematopoieic lineage, fractioned UCB cells were transplanted' into sublethaly irradiated severe combined immunodeficient (SCIO) mice. We transplanted 21 mice, 6 engrafted and 15 dead during the fist week post transplantation, probably by the fact that SCIO lineage had great irradiation sensibiliy than the others mice lineages, even when we use 300 rads .The engrafted group demonstrated multilineage engraftment, analyzed by fluorescenceactivated-cell sorting (FACS) with monoclonal antibody for human cells, and clonogenic studies with mice bone marrow cells, in methylcellulose culture with human recombinant stimulating factors. Our FACS results were: peripheral blood, 400 cells with 26,03% of C045, 4,50% of C02, 30,14% of CD3, 1,03% of CD19; lung, 2500 cells with 18,65% of C045, 16,32% C03 and 0,37% of CD19; bone marrow,1000 cells with 12,80% of C045, 4,45% of C03, 0,855 of C08 and 0,03% of C034; spleen, 2300 cells with 36,84% of C045, 28,27% of C03, and 1,62% of CD19. We had done the same analysis with one untransplanted mouse. There was not any positive cell in the F ACS analysis with monoclonal antibody for human cells. These results demonstrated that umbilical cord blood cells were capable to recover bone marrow after ablative. therapies and might be in the future, the ideal source of progenitors cells for transplantation and gene therapyMestradoClinica MedicaMestre em Ciências Médica