Hepatite C em doadores de sangue : diagnostico pela reação de transição reversa e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) e sua correlação com os testes imunoenzimatico (EIA) e imunoblot recombinante (RIBA)

Orientador: Fernando Ferreira CostaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: No Brasil, previne-se a transmissão por transfusão sangüínea do vírus da hepatite C com a triagem dos doadores de sangue realizada por meio da pesquisa do anti VHC pelo método de EIA e dosagem dos níveis séricos da ALT. A especificidade da triagem do anti-VHC por EIA, em populações de baixa soroprevalência, tem sido questionada. Assim, para avaliar-se a eficácia desta triagem, pesquisou-se a presença, com o uso da RT-PCR, do RNA viral em amostras de doadores de sangue, procurando-se, também, estabelecer as associações entre os resultados desta reação e os testes de EIA e RIBA. Procurou-se, ainda, detectar marcadores teciduais para o VHC, com a utilização de Um anticorpo monoclonal específico, pela técnica de imuno-histoquímica eimunofluorescência em cortes de tecido hepático parafinado. Foram estudadas 196 amostras de soro, coletadas no período de janeiro de 1994 a dezembro de 1995. Entre estas, 178 foram selecionadas de uma população de doadores de sangue voluntários do Centro de Hematologia e Hemoterapia da UNICAMP e, 18 de pacientes atendidos no Ambulatório do Grupo de Estudos das Hepatites da Disciplina de Doenças Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de Ciências Médicas desta Universidade. Dos 178, 147 (82,6%) apresentaram-se à triagem com resultados repetidamente reagentes para o anti- VHC e não-reagentes para o HBsBAg, anti-HBc, anti-lllV1/2, anti-HTL VI/IT, além de serem negativos para marcadores da Doença de Chagas e Sífilis. Os 31 (17,4%) restantes eram repetidamente negativos para todos os marcadores sorológicos acima citados e apresentavam níveis de AL T nonnais (grupo controle). As 18 amostras de pacientes estudadas eram negativas para a pesquisa do anti-HIV1/2 e foram investigadas sorologicamente para os diferentes tipos de hepatites, de acordo com a avaliação clínica. Os 14 T doadores foram subagrupados de acordo com os critérios baseados nas leituras das densidades ópticas das amostras em relação ao "cutoff' (DO/C) do teste de ElA para o anti-VHC e o nível de ALT. A seqüência do RNA do VHC foi detectada pela RT- "nested" PCR, utilizando-se "primers" da região 5' não-transcrita, que é a mais conservada do genoma viral. O ensaio de "imunnoblot" recombinante (RIBA-2) também foi realizado nas mesmas amostras. No subgrupo considerado ElA fortemente reagente, 95,4% apresentaram aumento nos níveis séricos de ALT, enquanto que no sub-grupo ElA fTacamente reagente apenas, 47,1% tiveram níveis de ALT elevados. No subgrupo ElA fortemente reagente houve 96,9% de co-positividade com o teste de RIBA. A realização deste mostrou-se necessária para definir a condição sorológica dos indivíduos EIA fracamente reagente, uma vez que apenas 53% confirmaram a positividade inicial, permanecendo 23,5% como indeterminados e 23,5% como negativos. Observou-se uma relação direta entre a reatividade contra o antígeno do core do VHC (c22.3) e a presença de partículas virais no soro. Entre os RIBA indeterminados (reativos apenas para o c22.3), 87,5% apresentaram positividade para a RT-PCR. Em 91,5% dos indivíduos com EIA fortemente reagente, detectou-se o RNA do VHC pela RT-PCR contra apenas 17,6% no subgrupo EIA fracamente reagente. A concordância entre os resultados positivos de RIBA e RT-PCR foi de 85,9%. Por estes achados conclui-se que os dois testes devam ser aplicados isolada ou seqüencialmente para confirmar a infecção pelo VHC, principalmente em populações com baixas prevalências da mesma, como é o caso dos doadores de sangue. Entre os indivíduos com hepatite crônica histologicamente confirmada não se encontrou nenhum caso com resultado de RIBA negativo. Em 92,3% deste grupo observou-se positividade para o RNA do VHC pela RT-PCR. Os testes de ElA e RIBA utilizados neste estudo apresentaram alta sensibilidade e especificidade, considerando-se como população positiva aqueles indivíduos com diagnósticos histopatológicos de hepatites crônicas, com positividade para aRT-PCR. Assim, conclui-se que a triagem sorológica, em nosso serviço, para prevenir a transmissão do VHC, na transfusão de sangue, mostrou-se eficiente e capaz de selecionar os doadores infectados, principalmente se for usada como critério a relação DO/C no teste de ELA. A utilização do anticorpo monoclonal específico, TORDJI-22, em tecido hepático parafinado pela técnica de imuno-histoquímica ou imunofluorescência não permitiu evidenciar a presença do VHC neste tecido em nossa casuística. Os testes de triagem sorológica (ELA e RIBA) associados ao método de RTPCR e ao diagnóstico anátomo-patológico propiciarão ao clínico manipular melhor as interrelações e as variáveis envolvidas na infecção pelo vírus CAbstract: The transmission of hepatitis C virus in Brazil is currently monitored either by an anti-HCV enzyme-immunoassay (ElA) or by the deterrnination of ALT serum levels. However specificity of the anti-HCV ElA in low seroprevalence populations has been questioned. ln order to evaluate the efficiency of this test, blood samples were screened for the presence of viral RNA using RT -PCR and the results then compared with those of the ElA and recombinant protein immunoblot assay (RIBA) tests. lmmunohistochemistry and immunofluorescence of paraffin embedded hepatic tissue were employed to detect HCV tis sue markers using a specific monoclonal antibody. A total of 178 serum samples obtained ITom voluntary blood donors at the Hematology and Hemotherapy Center (UNICAMP) and 18 samples from patients who were attended by the Hepatitis Group of the lnfectious and Parasitic Diseases Unit were studied between January, 1994 and December 1995. One hundred and forty-seven samples (82.6%) consistently reacted with antiHCV antibody but not with HBsBAg, anti-HBc, anti-HIV1/2, or anti-HTL VIlII antibodies; these samples were negative for syphilis and the Chagas' disease. The remaining 31 samples (17.4%) were consistently negative for all of the above serological markers and showed normal ALT levels (control group). The 18 samples obtained from hepatitis patients were negative for anti-HIV1/2 antibody. The 147 positive donors were divided into subgroups based on the outoff (C) for the optical density readings (OD) of the anti-HCV ElA test and on their ALT levels. The RNA sequence of HCV was detected by RT-nested PCR using primers from the 5' non-transcribted region which is the most conserved of the viral genome. A RIBA-2 was also performed on these samples. The majority (95.4%) of the samples that gave a strongly reactive EIA result also showed an increase in the serum AL T levels while only 47.1 % of the weakly reactive EIA subgroup had elevated serum AL T levels. The co-positivity of the EIA test with the RIBA test in the strongly reactive EIA subgroup was 96.9%.The RIBA test proved to be important and necessary in defining the serological status of the weakly reactive EIA subgroup; thus, 53% of the samples were EIA positivite, 23.5% were negative and in 23.5% was not determined. There was a direct positive relationship between the reactivity to the HCV core (c22.3) and the presence of serum viral particles. Among indeterminate RIBA results (reactive only to c22.3) 87.5% were positive by RT-PCR. HCV-RNA was detected in 91.5% of the strongly reactive EIA samples compared to only 17.6% observed in the weakly reactive EIA group. There was a high level of agreement 85.9% between the RIBA results and RT-PCR test. Based on this findings these two tests may be used either separately or sequentially to conflrm an HCV infection, particularly in populations whese the prevalence ofthis infection is low (as in the case ofblood donors). There were no RIBA negative results in individual with histologically conflrmed chronic hepatitis. Using RTPCR, RNA-HCV was detected in 92.3% of this group. Our results showed a high sensitivity and specificity for EIA and RIBA tests in individuaIs with a histopathological diagnosis ofchronic hepatitis and who were positive by the RT-PCR test. In conclusion, the serological screening as performed in our laboratory for HCV transmission in blood transfusions is efficient and capable of detecting infected donors, particularly if the OD/C report of the EIA test is used as a criterion. The specific monoclonal antibody TORDll-22 was unable to detect the presence of HCV in the hepatic tissue evaluated by immunohistochemical br immunofluorescent techniques. The EIA and RIBA tests, association with RT-PCR method and anatomicopathological diagnosis, may be useful in evaluating the relationships and parameters involved HCV infectionsDoutoradoAnatomia PatologicaDoutor em Ciências Médica