Efeito da concentração de soro fetal bovino e do dexametasona no crescimento e infiltração de celulas vero sobre geis de colageno tipo I

Orientador: Maria Lucia Furlan WadaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Células Vero foram cultivadas sobre géis 3D de colágeno tipo I ou em lamínulas de vidro por 48h com 10% de soro fetal bovino (SFB). Após este tempo de cultivo as células passaram a ser mantidas em meio sem SFB, com 10 % de SFB, com 10 % de SFB mais dexametasona (DEX) e com 20 % de SFB. Amostras foram fixadas após 48h, 120h e 240h de cultivo. Os géis foram incluidos em paraplast e cortados com 7Jlm de espessura. As amostras foram coradas com hematoxilina-eosina (HE), cresil violeta (CV), azul de toluidina (A T) e xylidine ponceau (XP). Foi realizado também imunocitoquímcia para colágeno IV (CaL IV) e para fibronectina (FN). Com as células cultivadas sobre lamínulas foram obtidos os índices mitóticos e as curvas de crescimento da cultura. Células cultivadas em colágeno por 24h, foram analizadas em microscopia eletrônica de varredura (MEV). Um ensaio em microplacas para a adesão celular com 24h de cultivo também foi realizado. As células que foram cultivadas sobre lamínulas e coradas com CV, em todos os casos analisados, mostravam morfologia irregular e com alguns prolongamentos, exceto nas regiões confluentes onde encontramos apenas células com formas poliédricas. Encontramos também a formação de grumos celulares nas amostras tratadas com DEX. Material bem corado com XP foi evidenciado tanto com 120h quanto com 240h de cultivo. Os grumos celulares nas amostras tratadas com DEX foram os pontos onde encontramos coloração mais intensa. O A T mostrou nas primeiras 48h células com citoplasma, núcleo e nucléolo metacromáticos. Com 120h de cultivo foram detectadas células com núcleos ortocromáticos, nucléolo basófilos e citoplasma levemente metacromático em quase todas as amostras, exceto nas tratadas com DEX, onde encontramos citoplasma intensamente metacromático. Com 240h de cultura encontramos células com citoplasma, núcleo e nucléolos metacromáticos (S/SFB e 10% SFB) e células com núcleos ortocromáticos, nucléolos e citoplasma metacromáticos (10% SFB+DEX e com 20% SFB). A imunocitoquímica mostrou a presença de CaL IV nas amostras mantidas S/SFB, com 10% SFB e com 20% SFB, mas não nas células cultivadas com DEX. Encontramos a presença de FN em todos os casos, porém foi encontrado um arranjo mais homogêneo nas células que cresceram na presença de 10% SFB+DEX e 20% SFB. Dados citoquímicos e imunocitoquímicos mostraram que o DEX interfere no padrão de crescimento de células sobre lamínulas. A MEV mostrou um grande espalhamento celular e deposição de material fibrilar, cuja deposição é estimulada pela variação da concentração dos componentes do SFB. O ensaio com microplacas mostrou que a adesão das células ao substrato também é estimulada pelo SFB. A análise morfológica feita com HE mostrou nos géis nas primeiras 48h uma monocamada de células achatadas, embora em alguns pontos as mesmas mostravam-se com duas ou três camadas de células arredondadas. Ambos os casos mostraram-se bem evidenciados pelo XP e as células apresentavam também metacromasia quando corado com AT. Com 120h e 240h em meio S/SFB ou com 10% de SFB, coradas com HE, foram observadas células formando um estrato com várias camadas arredondadas além de vários pontos de infiltração para o interior do substrato. Estas células apresentavam núcleos e citoplasma metacromáticos, quando corados com A T. Também encontramos granulações metacromáticas ao redor das células no interior do gel. Nesses experimentos o XP mostrou células bem coradas tanto no citoplasma como no núcleo. O gel também foi levemente corado pelo XP. As granulações presentes na matriz colagênica junto as células infiltradas também foram coradas pelo XP. A análise imunocitoquímica mostrou deposição de FN mas não de COL IV. Concluimos que nessas condições experimentais, S/SFB ou com 10% de SFB, as células cultivadas nos géis de colágeno, organizam uma estrutura semelhante a um tecido conjuntivo frouxo. Por outro lado, a HE mostrou que as células que foram tratadas com DEX (um inibidor da síntese de colagenases) e com 20% de SFB (que contém