Identificação e caracterização de alterações moleculares no gene do fator IX em pacientes com hemofilia B

Orientador: Fernando F. CostaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A hemofilia B é uma doença hemorrágica hereditária caracterizada pela deficiência ou anormalidade da atividade coagulante do fator IX (FIX:C). O gene que controla a produção do fator IX está localizado no cromossomo X, na posição Xq27.1. É constituído por oito exons e sete íntrons abrangendo uma região de aproximadamente 33,5 kb que origina um mRNA de 2,2 kb. A análise do gene do fator IX de hemofílicos indica que cerca de 95% das alterações moleculares são identificadas nas seqüências correspondentes à região promotora, regiões codificadoras e sítios de excisão de íntrons. A maioria das mutações apresenta origem independente. As mutações de ponto são as alterações moleculares descritas em aproximadamente 85% dos casos de hemofilia 8, sendo o restante devido a perdas ou inserções gênicas. A análise do polimorfismo de conformação de hélices simples de DNA (SSCP) possibilita o rastreamento rápido e eficaz de mutações. A identificação das mutações pelo seqüenciamento direto do DNA permite a determinação precisa da portadora, diagnóstico pré-natal e viabiliza o aconselhamento genético. A comparação das mutações e quadros clínicos dos pacientes estudados neste trabalho com aqueles descritos em publicações anteriores também permitem a avaliação do efeito destas alterações na atividade do fator IX. Neste estudo foi realizada a análise das alterações moleculares no gene do fator IX de 29 pacientes portadores de hemofilia 8. A metodologia consistiu na amplificação das regiões codificadoras e promotora do gene do fator IX pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e posterior análise do SSCP radioativo e não-radioativo, este último em um sistema automático de eletroforese (Phastsystem® Pharmacia), corado com nitrato de prata. A identificação das mutações foi realizada pelo seqüenciamento direto do fragmento do DNA com padrão anormal no SSCP. Com o emprego destas técnicas foi possível o reconhecimento de alterações moleculares em todos os pacientes analisados. Cinco mutações de ponto foram detectadas apenas na análise de SSCP radioativo. O seqüenciamento dos fragmentos com padrão de migração anormal permitiu a detecção de 31 mutações de ponto no gene do fator IX. Destas alterações, 22 representavam mutações diferentes, das quais 6 ainda não descritas na literatura. Em um paciente foram encontradas três alterações nucleotídicas, uma delas uma mutação silenciosa na posição 31.093. A análise dos haplótipos indica que 24 mutações identificadas neste estudo apresentam origem independente. Quatro pacientes originários do Estado do Pará apresentam mesma mutação e haplótipo idêntico evidenciando a ocorrência de um possível efeito do fundador. O estudo das mutações no gene do fator IX apresenta-se como um modelo para a determinação do padrão das alterações moleculares em linhagens de células germinativas. O padrão de mutações identificado no gene do fator IX é semelhante entre Caucasóides, Asiáticos, e pequenos grupos de Hispânicos e Negróides. A população brasileira apresenta origem étnica bastante heterogênea e é representada por imigrantes provenientes da Europa, África, Ásia e pelas populações indígenas residentes mostrando-se, desta forma, distinta das demais populações previamente analisadas. O padrão de mutação verificado neste estudo é semelhante àquele observado em outras populações o que sugere a predominância dos processos endógenos na determinação das mutações espontâneas em células germinativasAbstract: Hemophilia B is a common hereditary bleeding disorder resulting from a deficiency of functional factor IX. The gene of factor IX spans about 33,5 kilobases and is situated on the distal portion of the long arm of X-chromosome at band Xq27.1. The gene is composed of eight exons and seven introns. Around 95% of mutations leading to hemophilia B occur in the 2,2 kilobases of the factor IX gene that included the promotor region, coding sequences, and splice junctions. Most are independent mutations. Point mutations account for about 85% of independent mutations. Deletions, insertions, and more complex gene rearrangements account for the remainder of the molecular mechanisms responsible for hemophilia B. The Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) analysis is a rapid and sensitive technique that can be used to detect single base substituions. Direct Sequencing of amplified genomic DNA defines the location and nature of any mutation and is a necessary final step of any detection method. The SSCP analysis followed by DNA sequencing allows accurated carrier detection and prenatal diagnosis, eliminating the need for informative segregetion of markers. Hemophilia B is a good model for deducing the underlying pattern of spontaneous germ-line mutation in humans. In addition, the study of naturally occurring mutations, combined with the study of genetically engineered mutant recombinant proteins, has yielded a wealth of information regarding structure-function relationships of factor IX. The pattern of mutation is similar among .Caucasians, Asians, and small groups of Blacks and Hispanics. The ethnic origin of Brazilian population is highly. heterogeneous (imigrants from Europe, Africa, Asia and, also, Indigenous) and different from previous populations studied. In order to elucidate the genetic basis of a distinct population and to perform a precise carrier detection, we carried out a study of 29 patients with hemophilia B of Brazilian origino The screening protocol consisted of amplification of coding and promoter regions of factor IX gene by PCR, followed by a radioactive and non-radiactive analysis of single-strand conformation polymorphisms (SSCP) on the PhastSystem Df Pharmacia®. The confirmation of the molecular defect was done by sequencing of the exon with abnormal electrophoretic mobility on SSCP. The results of SSCP revealed abnormal mobility in ali 29 patients and 31 point mutations were determined by direct sequencing of DNA. Twenty-two diferent single base pairs were identified: fifteen in exon 8, three in exon 6, and two in exon 4. Six non previously described point mutation were identified. Three point mutations were found in patient HB31, one of them silent. Haplotype analysis determined that at least twenty-four point mutations could be considered of indenpendent origino Our results shown that this methodology has the potential of detecting ali genetic defects in patients of Brazilian origin with hemophilia B. A large number of recurrent mutations described here is in accordance with data from distinct patients from around world and suggest that the mutation in the factor IX gene is likely the result of endogenous process rather than enviromental mutagensMestradoGeneticaMestre em Ciências Biológica