Purificação, caracterização fisico-quimica e atividade biologica de inibidores de serinoproteinases de sementes do genero Crotalaria

Orientador: Sergio MarangoniDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A presença de inibidores de serinoproteinases foi investigada em sementes das plantas Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente à murcha bacteriana e Croetalaria juncea Papilionoideae) . não resistente à murcha bacteriana. (Leguminosae) A purificação do inibidor de Croetalaria paulina por cromatografia de troca iônica e subsequente cromatografia em fase reversa, evidenciaram nessa espécie, uma proteína com cadeia polipeptídica única. A massa molecular ao redor de 20 kDa é similar aos da família de inibidores vegetais do tipo Kunitz A coloração para inibidor de tripsina após focalização isoelétrica demonstrou a presença de inibidor com ponto isoelétrico ao redor de 4,5, e a análise de aminoácidos revelou a presença de 176 resíduos. Os inibidores de Croetalaria atuam seletivamente sobre serinoproteinases. Extratos de sementes de Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistente e Croetalaria juncea não resistente à murcha bacteriana foram testados para atividade de inibição contra tripsina e quimotripsina bovina, porcina e humana. Entre estas amostras, Croetalaria paulina exibiu a mais alta inibição, com tripsina humana sendo melhor inibida do que tripsina bovina e porcina. A variedade resistente de Croetalaria juncea inibiu melhor tripsina bovina do que a variedade não resistente. As três quimotripsinas não foram inibidas por estas amostras, com exceção da quimotripsina bovina que foi fracamente inibida pelo extrato de Croetalaria paulinaAbstract: The presence of serine proteinase inhibitors was investigated in the seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non resistant to bacterial infection This plants belongs to Leguminosae (Papilionoideae) family. The purification of inhibitor from Croetalaria paulina by ion-exchange chromatography and subsequent reverse phase chromatography using a C18 column showed the presence of a single polypeptide chain. The purifited serine proteinase inhibitor (CpTI), has a molecular mass of 20 kDa in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE 10-20%) suggesting that this protein belongs to the Kunitz-type plant inhibitors family. Staining for inhibitors trypsin afier isoeletric focusing showed the presence of inhibitors with isoeletric point about 4,5 and amino acid analysis revealed the presence of 176 amino acids residues. Crotalaria inhibitors act selectively on serine proteinases. Extracts from seeds of Croetalaria paulina, Croetalaria juncea resistant and non-resistant were tested for inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin, from cattle, pig and humans. Within these samples, Croetalaria paulina exhibited the highest activity, inhibiting human trypsin better than bovine and porcine. The resistant Croetalaria juncea variety inhibited bovine trypsin better than the non-resistant one. The three kinds of chymotrypsin were not inhibited by these samples excepted bovine chymotripsin, that was weakly inhibited by the Croetalaria paulina extractMestradoBioquimicaMestre em Ciências Biológica