Pigmentos obtidos de Chromobacteriun violaceum e Serratia marcescens, propriedade tripanocida da prodigiosina e estudos toxicologicos

Orientador: Nora Marcela Haun QuirosDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Chromobacterium violaceum é um microrganismo de larga distribuição podendo ser encontrado no solo, água e no Rio Negro (Amazônia). Esta bactéria Gram negativa produz um pigmento denominado violaceína, que apresenta alguma atividade tripanocida. Como a violaceína é produzida em pequena quantidade o propósito inicial desse estudo foi investigar cepas diferentes provenientes do Rio Negro que produzissem a violaceína em um maior rendimento. Um sedimento coletado do Rio Negro foi inoculado em caldo simples, 30°C/24 h e posteriormente inoculado através de estrias em ágar nutriente. Somente três tipos de colônias - branca, amarela e vermelha cresceram (todas bactérias Gram negativas). Após dois dias de incubação a colônia branca adquiriu tonalidade violeta indicando a produção de violaceína. Análises espectrais, UV/Vis, IV (Infra Vermelho) e RMN (Ressonância Magnética Nuclear), confirmaram a presença da violaceína. Para determinar as características de C. violaceum e sua variante não pigmentada, testes laboratoriais foram realizados. A coloração pelo Gram, motilidade e estudos bioquímicos e de crescimento indicaram que as colônias branca/violeta e amarela eram C. violaceum. A colônia vermelha era Serratia marcescens (Chromobacterium prodigiosum) a qual produz o pigmento com ação antibiótica chamado prodigiosina. Os dados espectrais (UV/Vis, IV e RMN) reforçam essa conclusão. O pequeno número de bactérias isoladas na amostra confirma a alta atividade antibiótica dos pigmentos produzidos pela C. violaceum (violaceína) e S. marcescens (prodigiosina) na água do Rio Negro. A quimioterapia da doença de Chagas permanece um problema sem solução, e a pesquisa para drogas alternativas está em andamento. A terapia atual dessa doença é insatisfatória e somente o Nifurtimox está em uso, com diversas restrições na administração em pacientes crônicos, devido aos seus efeitos colaterais. Desse modo é de importância fundamental a pesquisa de novas drogas com mecanismos de ação diferentes do Nifurtimox com o objetivo de evitar esses problemas. A violaceína e a prodigiosina extraída da C. violaceum e da S. marcescens, respectivamente apresentam atividade tripanocida, a primeira possui um ID50. de 46 mM e a segunda, menos que 100 mM. A avaliação da titotoxicidade foi realizada através da inibição da síntese de DNA, redução do MTT e captação do Vermelho Neutro (VN), utilizada em células de hamster chinês V-79 (M8). No teste de viabilidade através da redução do MTT o ID50 foi de 6 mM para a prodigiosina, 7mM para a violaceína e 500 mM para o Nifurtimox, no teste do VN o ID50 para a prodigiosina foi de 1,0 mM, 12 mM para a violaceína e 250 mM para o Nifurtimox. A prodigiosina resultou em um valor de ID50 de 20 mM, o Nifurtimox de 100 mM e a violaceína de 5 mM obtidos através da inibição da síntese de DNAAbstract: Chromobacterium violaceum is a widely distributed microorganism. It is in soil, water and in the Rio Negro (Amazon). This Gram negative rod shaped bacteria produces the pigment violacein, which has shown trypanocide activity. Since violacein is produced in small quantity, the inicial purpose of this study was to investigate differents strains of bacteria from Rio Negro which may produce violacein in highest yield. Sediment was collected from Rio Negro, inoculated in simple broth, 30°C /24 h and striated in simple agar. Only three kinds of colonies - white, yellow, and red grew (rod Gram negative bacteria). After two days the white strain changed to violet indicating violacein production. Spectral analysis, UV/Vis (UV/Visible), IR (Infra Red) and NMR (Nuclear Ressonance Magnetic), confirmed the presence of violacein. In order to determine of C. violaceum characteristics and its non pigmented variants, laboratories tests were undertaken. Gram'stainning, motility, morphological, growth and biochemical studies indicated that the white, yellow and violet colonies were C. Violaceum. The red one was Serratia marcescens (Chromobacterium prodigiosum) which produces the red pigment antibiotic prodigiosin. The spectral data (UV/Vis, IR and NMR) reinforce this conclusion. The low number of microorganisms isolated in the sample confirm the high antibiotic activity of the pigments produced by C. Violaceum (violacein) and Serratia marcescens (prodigiosin) in the Rio Negro water. The chemotherapy of Chagas' disease remains an unsolved problem, and the search for alternative drugs is in course. Current therapy of this disease is unsatisfactory and only Nifurtimox is in general used, with several restricted applicability for chronic patients, as well being deleterious effects. Thus, it is of fundamental importance to search for new drugs with different mechanism of action of Nifurtimox in order to avoid these problems. We have found a potential compounds for the treatment of Chagas' disease, the pigments extracted from S. marcescens and C. violaceum, respectively prodigiosin (ID50 of less 100 mM) and violacein (ID50 of 46 mM). Evaluation ID50 through DNA synthesis inhibition, soluble tetrazolium/formazan (MTT) and Neutral Red (NR) tests on V-79 Chinese hamster (M-8) cells were carried out. Using MTT viability test, ID50 was 6 mM for prodigiosin, 7 mM for violacein and 500 mM for Nifurtimox, and for NR test the ID50 was 1.0 mM, 12 mM and 250 mM for prodigiosin, violacein and Nifurtimox, respectively. Prodigiosin resulted in a ID50 value of 20 mM, for violacein of 5 mM and for Nifurtimox of 300 mM obtained through DNA synthesis inhibitionMestradoBioquimicaMestre em Ciências Biológica