Produção, purificação e caracterização de a-galactosidase fungica. Hidrolise de oligossacarides do extrato de soja

Orientador: Yong Kun ParkTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e AgricolaResumo: Foi estudada a produção de a-galactosidase por Aspergillus orizae , tanto em meio submerso como por fermentação semi-sólida. A enzima foi levemente induzida por rafinose e estaquiose, enquanto um extrato de oligossacárides da soja, fermentado por S, cereviciae (3.7% de açúcares totais), mostrou excepcional capacidade de indução. Simultâneamente, o microrganismo produziu invertase, esta de forma constitutiva. A a-galactosidase, parcialmente purificada, mostrou um Km de 2.04 mMol para PNPG e 140 mMol para melibiose. Para os mesmos substratos os valores de Vm foram de 0.36 µMol de PMP e 0.64 µMol de glucose/min/mg de proteína. O peso molecular foi estimado em 200 000 e a enzima foi inibida competitivamente por galactose e frutose e de forma não competitiva por glucose. Ag+, Hg+ e p-clororaercuribenzoato afetaram drasticamente a atividade enzimática, sugerindo a presença de grupo(s) -SH no sítio ativo. A enzima mostrou atividade máxima em pH 4,0 e mais de 70% da atividade máxima em pH 6,3. Nenhuma perda de atividade foi observada, quando tratada entre 35 a 50ºC, por 15 minutos. O preparado bruto contendo a-galactosidase e invertase diminuiu substancialmente os teores de rafinose e estaquiose do Extrato de Soja, o que sugere a possibilidade de seu emprego no tratamento de produtos da leguminosa, visando eliminar aqueles galastoligossacárides, apontados como causadores da flatulênciaAbstract: The production, of a-galactcsidase by a strain of Aspergillus orizas was observed either by sub merged culture method or Koji method. The enzyme was slightly induced by raffinose and stacchyosef while in a previously fermented oligosaccharides extract from soybean with 3.7 per cent of total sugar the yield was greatly increased. The partially purified a-gaiactosidase showed a Km value of 2.04 and 140 mMole respectively for PNPG and melihiose. The Vm value was 0.36 µMole of PNP and 0.54 of glucose/rain/mg, of protein for the same substrates. The molecular weight was estimated in 200 000 by gel filtration in Sephadex G-200 and the enzyme was competitively inhibited by galactose and fructose and non competitively by glucose. Ag+, Hg+ and p-Chloromercuribenzoats remarkdly inhibited the enzyme activity suggesting the presence of SH groups in the active site. The optimum pH was 4,0 and more them 70% of the maximum activity was found in pH 6.3. No loss of activity was shown when submitted to heat treat: meant between 35 ¿ 50º C, for 15 minutes. Enzymatic filtrate substantially de creased the contents of raffinose and stacchyose from soybean milk suggesting the possibility of its application to eliminate soybean galactooligosccharydes responsible for flatulence troublesDoutoradoDoutor em Ciência de Alimento