Estudo cinetico da invertase livre e imobilizada em alginato de calcio

Orientador: Francisco Maugeri FilhoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: Neste trabalho foi dado ênfase especial aos aspectos cinéticos envolvidos na hidrólise da sacarose pela enzima invertase, nas formas livre e imobilizada em gel de alginato de cálcio. Os parâmetros cinéticos foram determinados levando em conta as taxas iniciais de reação, de forma a evitar os fenômenos de inibição causados pelo produto glicose e frutose). Para tanto estudaram-se os efeitos do pH e temperatura na atividade enzimatica, assim como a estabilidade termicada. Os parâmetros cinéticos para a enzima livre foram determinados a 40 e 50 ºC, baseando-se em três suposições sobre o "efeito físico" na cinética de transformação do substrato: duas relacionadas com a concentração de água livre e outra baseada na difusividade molecular da sacarose. Para a enzima imobilizada os parâmetros intrínsecos foram determinados a 40°C em reator de mistura operado continuamente, com relações geométricas padrão. O coeficiente de difusão efetivo da sacarose, necessário para a determinação dos parâmetros cinéticos da enzima imobilizada, foi determinado por dois métodos: o primeiro utilizando-se o modelo de placa semi-infinita em contato com uma fase líquida de concentração constante de sacarose, no estado não estacionário e, o segundo, utilizando-se esferas do gel inicial mente isentas de sacarose e imersas em um volume finito de solução de sacarose de concentração conhecida em estado não estacionário. Na caracterização da invertase, obteve-se respectivamente para a enzima livre e imobilizada pH ótimo de 4,5 e 4,0; e temperaturas de máxima atividade ao redor de 60ºC para a enzima nas formas livre e imobilizada. Quanto à estabilidade térmica, a enzima mostrou-se muito estável abaixo de 40 °C. Entretanto a enzima imobilizada, mostrou-se menos estável que a forma livre. Para as formas livre e imobilizada, respactivamente, as energias de ativação obtidas para a reação de inversão foram de 7853 cal /mol e 10358 cal /mol. enquanto que as energias de ativação da degradação térmica obtidas foram de 141171 cal/mol e 116883 cal/mol. O melhor ajuste do modelo cinético, para taxas iniciais de reação, foi obtido quando se considerou o modelo cinético de inibição pelo substrato, corrigido por um fator relacionado com a difusividade de massa. Os valores das constantes de Michaelis -Menten (Km) e de inibição (Ki) foram respectivamente 0,0506 mol/l e 0,309 mol/l a 40°C e 0,0587 mol/l e 0,377 mol/l a 50ºC. O modelo clássico do Michaelis-Menten foi o que melhor se ajustou à cinética de reação com enzima imobilizada, tanto em termos de constantes aparentes como efetivas. Hão foram observados os fenômenos de inibição pelo substrato e efeitos difussionais verificados no caso da enzima livre, até a concentração de substrato estudada (500 g/l). Os valores intrínsecos de Km para a enzi ma imobiliizada foi 0,031M e Vmax foi de 0% do V¬max observado para a enzima livre, nas mesmas concentrações enzimáticas. A difusividade efetiva da sacarose no gel foi de 0,5.10-5 cm2/s , correspondendo a 67% da di fusivi dade da sacarose em solução.Abstract: In this work special emphasis was given to the study of the kinetics of sucrose hydrolysis by invertase. The enzyme was used in free as well immobilized in calcium alginate forms. The kinetic parameters ware determined considering the initial rates of reaction, in order to avoid the iinhibition phenomena caused by the products glucose and fructose. The pH and temperature effects on enzymatic activity, as well as the thermal stability of enzyme were studied. The parameters for the free enzyme were determined at 4-0°C and 60°C. Three assumptions related to the "physical effect" on the kinetic of substrate transformations were considered: Two of them were related to the concentration of free water and the other one was related to the molecular diffusivity of sucrose. The intrinsic parameters of the immobilized enzyme were determined at 40°C i n a continuous stirred tank reactor, with standard geometric relations. The effective diffusion coefficients of sucrose, needed for the determination of the kinetic parameters for the immobilized enzyme were determined by two methods: The first one, used the theory of semi infinite plate in contact with a liquid phase with constant concentration of sucrose, at unsteady state and, the second, used gel spheres, initially free of sucrose, that were immersed in a fini te volume of solution of known sucrose concentration, at unsteady state. The optimum conditions of enzymatic reaction were pH 4,0 ¿ 4,5 and 60ºC in both free and immobilized forms. In terms of thermal stability the enzyme was stable at temperature lower than 40 C. But, the immobilized enzyma was less stable than the free form. The activation energies obtained for inversion reaction were found to be 7853 and 10258 cal/mol. While the deactivation energies were 141171 and 116883 cal/mol for the free and immobilized forms, respectively. Better agreement for the kinetic model , for the initial rates of reaction, was obtained when the kinetic model of substrate inhibition was considered, corrected by a factor related to mass diffusivity, Values for Michaelis-Menten (Km) and the inhibition (Ki) constants were respect!vely, 0.0506 mol/l and 0. 309 mol/l at 40° C and 0.0557 mol/l and 0.377 mol/l at 50°C. On the other hand, the classic model of Michaelis-Menten fitted well the results for immobilisted enzyme, either in terms of apparent or effectives constants. The inhibition phenomena of substrate were not observed neither diffusional effects, as verified for free enzyme, up to a substrate concentration of BOO g/1. The intrinsic value of Km for immobilized enzyme was 0.031M and V was found to be 60% of the observed Vmax for the free enzyme, in the same enzymic concentration. The sucrose effective diffussivity in the gel was 0.5 .10-5 cm2 /s, corresponding to 67% of the sucrose diffusity in solution.MestradoMestre em Engenharia de Alimento