Tecnicas de protoplastização e isolamento de DNA de alto peso molecular de aspergillus niger

Orientadores: Renato Bonatelli Junior, Maristela O. Azevedo, Maria Sueli S. FelipeDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Foram estabelecidas neste trabalho, duas metodolo-gias para linhagens de Aspergillus niger com o interesse voltado para sua utilização na Tecnologia do DNA Recombi- nante (TDR). A primeira delas teve por objetivo o melhoramento da técnica de produção de protoplastos para esta linhagem, assim como a definição de melhores condições de regenera-ção. As melhores preparações de protoplastos provieram do micélio desenvolvido _na presença de Tween 80. Durante a produção foi possível obter até 2,1 x 108 protoplastos/ml quando o sulfato de magnésio 0,5M foi utilizado como estabilizador nesta etapa. A associação do sorbitol ao MgSO4, em baixa concentração (50 mM) possibilitou um aumento signifi-cativo da taxa de regeneração (de até, aproximadamente 20%) quando o sorbitol foi mantido como único estabilizador. Os clorotoplastos obtidos pelo método de GAMBINO e col. (1984) por nós adaptado, apresentaram-se túrgidos e permitiram uma análise cito lógica com visualização de numerosos núcleos. A segunda metodologia objetivou a melhoria do pro-cedimento da extração de DNA deste fungo resultando em uma preparação rápida (3,5 horas de manipulação) em que o DNA apresentou as seguintes características: - peso molecular elevado ( 50Kb) quando comparado ao mar-cador fago ?. -alto grau de pureza (A260: A280= 1,8 - 2,0) . - susceptibilidade à ação de enzimas de restrição (Eco RI e Pst I) e de ligação (T4 DNA-ligase) A determinação da quantidade de DNA obtido após extra-ção, utilizando-se a metodologia desenvolvida durante o trabalho, foi feita por dosagem colorimétrica da difenila-mina (DF A). A recuperação do DNA extraído foi de 70% e sua alta reprodutibilidade permitiu inclusive, autilização desta metodologia para extração desta macromolécula de ou-tros fungos filamentososAbstract: This research was done aiming the improvement of two methods of great relevanceto the Recombinant DNA Tech-nology (RDT) in Aspergillus niger. Firstly, the method of production and regeneration of protoplasts was improved. The best protoplasts preparations (2. 1 x 108 protoplasts/ml) were obtained when the my-celium was grown in medium containing Tween 80 and magne-sium sulphate 0.5M, the latter used as an osmotic stabili-zer. However, regeneration could only be significantly im-proved when magnesium sulphate was used at a lower concen-tration (50 mM) associated with sorbitol (1.2 M) during the production of protoplasts. Cytological analysis with protoplasts isolated by using the method of GAMBINO et alii (1984)revealed that up to 32 nuclei can be counted per protoplast. The method for isolation of DNA from this species was also improved. The final procedure is rapid (3.5 hours of manipulation before cesium chloride ¿ ethidium bromide gradient) and DNA isolated has showed the following characteristics: - high molecular weight; approximately 50 Kb. ¿ low level of proteic contamination (A260: A280= 1,8 - 2,0).- susceptibility to restriction (Eco RI and Pst I) and ligation (T4 DNA - ligase) enzymes. The DFA method was -.applied to estimate the recovery of DNA by using this improved procedure. DNA yields as high as 70% (ratio between final and inicial DNA concentrations) were obtained. The improved procedure has also proved to be suita-ble for extraction of DNA from others species of filamen-tous fungiMestradoGeneticaMestre em Ciências Biológica