Ação toxica da estreptozotocina em culturas celulares de mamiferos

Orientador: Maria Edwiges HoffmannDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A estreptozotocina é uma nitrosoamida de ocorrência natural que tem sido largamente utilizada como indutora de diabete em animais experimentais. Estudos sobre o mecanismo de ação da STZ apontam o DNA como alvo molecular de seus efeitos, pela sua reatividade como agente alquilante. Agentes alquilantes são capazes de induzir uma resposta adaptiva em bactérias e em alguns tipos de células de mamíferos. Isso nos levou a pesquisar os efeitos da STZ na taxa de síntese da DNA de células de mamíferos (fibroblastos de hamster chinês, linhagem V79). A STZ inibiu a taxa de incorporação de timidina-3H em células V79 de maneira dependente de dose. Realizando-se um tratamento com doses parceladas (0,38 mM e 11,0 mM) observou-se um aumento estatisticamente significativo (teste de Kruskall-Wallis) da incorporação de timidina-3H em relação aos valores obtidos para a dose tóxica de 11,0 mM. Estes resultados indicam que a STZ, similarmente a outros agentes alquilantes, é capaz de induzir uma resposta adaptativa em fibroblastos V79. Analisando também os efeitos da STZ sobre a taxa de síntese de DNA na linhagem celular humana Hela, observamos um padrão diferente de inibição quando comparado à linhagem V79. As curvas de sobrevivência celular ao tratamento com STZ mostraram, entretanto, uma atividade citotóxica aparentemente paradoxal com os resultados de inibição de síntese de DNA: a linhagem humana mostrou-se mais sensível ao efeito letal da STZ. Estes resultados sugerem que a toxicidade da droga não está relacionada exclusivamente com mecanismos de lesão do DNA, podendo sua ação alquilante ser também exercida sobre outros alvos celulares. Além disso, observamos que em comparação com a STZ, o análogo não diabetogênico MNU, mostrou ser uma toxina mais potente para células V79. Entretanto, o padrão de inibição de síntese de DNA de ambos os compostos não são suficientemente diferentes para corroborar a idéia de que o DNA é o único alvo de ação da STZ. Para determinar se as mitocôndrias poderiam consistir num outro alvo de ação da STZ e MNU, analisamos os efeitos dos dois agentes em mitocôndrias "in situ" de célula V79 permeabilizadas com digitonina. A determinação do fluxo de Ca++ e consumo de oxigênio indicaram que estes dois agentes aumentam a permeabilidade da membrana mitocondrial. AMNU mostrou-se mais tóxica para mitocôndrias que a STZ, o que concorda com seu maior efeito letal. Os resultados citados indicam uma possível explicação alternativa para a ação tóxica da STZ e MNU, sugerindo que além de danos ao DNA, injúrias às mitocôndrias exercem um papel crítico na citoxicidade destes compostos nitrogenados e na ação diabetogênica da STZAbstract: Streptozotocin is a naturally occurring nitrosoamide that has been extensively used as diabetes inducer in experimental animal models. Studies at the molecular level indicated the DNA as the major target of STZ, because of its alkylation properties. It¿s known that alkylating agents induces an adaptive response in bacterias and in some mammalian ceIl lines. This led us to investigate the effects of STZ on DNA synthesis rate in V79 fibroblasts.STZ inhibited timidine-3H uptake in this cell line in a dose dependent manner. In a split-dose protocol (0,38 mM and 11,0 mM) we observed an increase in DNA synthesis rate when compared to that for the higher dose treatment only. Although this increase in DNA synthesis rate is small it was reproducibly found and statistically significant (Kruskall-Wallis test). These results show that STZ, similarly to other alkylating agents, induces an adaptive response in V79 cells. In comparison to V79 cells, HeIa human cell line showed a different DNA synthesis inhibition pattern: at the same concentration, STZ showed to be a much more potent toxin to V79 cells. Determinations of cellular survival capacity to STZ treatment showed, however, an absence of parallelism between both effects, the HeIa cells being more susceptible to the STZ lethal effect than V79 one. These results indicate that STZ toxicity isn't exclusively related with DNA and, therefore, aIkylation in targets other than DNA may be involved on the STZ toxicity mechanism. Besides. We observed that, in comparison to STZ, the non-diabetogenic analogue MNU, showed to be a more potent toxin to V79 cells. However, the DNA synthesis inhibition patterns of bath drugs were not much different to support the view that the DNA is the unique target for their toxic action. With the aim to determine wether the mitochondria could be another target for STZ or MNU inducing cell killing, we analysed the effects of both drugs in mitochondria "in situ" of digitoninpermeabiIized V79 ceIls. Determination of Ca++ fIux and oxygen consumption have indicated that these drugs increase the permeability of the inner membrane of mitochondria. The order of mitochondria susceptibility to MNU was markedly higher than to STZ in accordance to their killing effects. The results of the present studies provide an alternative for the toxic action of STZ and MNU, suggesting that besides DNA damage injuries to mitochondria could exert a critical role in the citoxicity of these nitroso coumpounds and in the diabetogenic action of STZMestradoGeneticaMestre em Ciências Biológica