Site actif de la glucocérébrosidase humaine : prédictions structurales et validations expérimentales

La glucocérébrosidase (GC) est une enzyme lysosomale qui catalyse la dégradation du glucocérébroside en glucose et céramide, et dont le déficit enzymatique est responsable de la maladie de Gaucher. Cette glycosyl hydrolase (GH), non encore cristallisée, appartient au clan GH-A des GH qui regroupe de très nombreuses enzymes fonctionnant selon un mécanisme catalytique de conservation de la configuration anomérique du sucre. L’analyse comparative de l’ensemble des séquences protéiques du clan GH-A par la méthode de prédiction structurale « Hydrophobic Cluster Analysis » (HCA) a suggéré l’existence d’une structure de type tonneau (α/β)8 pour le domaine catalytique de toutes ces enzymes. Les deux acides aminés catalytiques (des résidus glutamates) directement impliqués dans l’hydrolyse de la liaison b-glucosidique du substrat ont été positionnés respectivement à l’extrémité C-terminale des brins β4 et β7 du tonneau catalytique. Un modèle structural de type tonneau (α/β)8 a ainsi été proposé pour le site catalytique de la GC et les acides glutamiques 235 et 340 de l’enzyme ont été potentiellement impliqués en tant que catalyseur acide-base (E235) et nucléophile (E340). Une validation des prédictions HCA a ensuite été recherchée par la mutagenèse substitutive de chaque glutamate du couple catalytique par un acide aminé ne pouvant pas participer à la réaction enzymatique (alanine). Des mutants E235A et E340A exprimés à l’aide de rétrovirus recombinants dans des cellules hétérologues dépourvues d’activité GC endogène se sont révélés totalement inactifs alors que leur biosynthèse et leur maturation étaient normales. Les résidus E235 et E340 ont ainsi été très fortement impliqués dans l’activité catalytique de la GC. Ces travaux ont illustré d’une manière plus générale, l’importance d’une complémentarité entre des approches de prédictions de structure et de vérifications expérimentales pour la caractérisation du site catalytique d’une enzyme impliquée dans une maladie génétique humaine