Radiobiological effects of low-dose pre-irradiation on human cell lines HT29 and MRC5

Radioterapija (RT) je jedan od najvažnijih modaliteta lečenja solidnih malignih tumora i koristi je više od 50% pacijenata (52,3%) sa malignim tumorima. Nauka koja proučava efekte elektromagnetnog zračenja na biološke sisteme naziva se radiobiologija. Radiobiologija se fokusira na odgovor ćelija, tkiva i organizma kao celine na jonizujuće zračenje i proučava mehanizme radiobiološkog odgovora. Izlaganje ćelija niskim dozama JZ koje su nakon određenog vremenskog intervala praćene uobičajenim radioterapijskim dozama naziva se radioadaptivno zračenje. Adaptivni odgovor u sebi može da sadrži nekoliko fenomena: hiperradiosenzitaciju/radiorezistenciju, “bystander” efekat i radioadaptivni efekat u užem smislu. O molekularnim mehanizmima koji stoje iza navedenih efekata ne zna se dovoljno. U ovom radu ispitivan je odgovor malignih i zdravih ćelija na različite modalitete jonizujućeg zračenja u cilju boljeg poznavanja puteva ćelijske smrti i preživljavanja. Potpuno razumevanje molekularnih puteva koji vode u apoptozu ili u preživljavanje ćelija nakon izlaganja jonizujućem zračenju moglo bi koristiti u iznalaženju novih i efikasnijih strategija i modaliteta lečenja malignih tumora u cilju njihove potpune eredikacije. U istraživanju su korištene dve humane ćelijske linije ćelijska linija humanog kolorektalnog karcinoma HT-29 i ćelijska linija humanih fetalnih fibroblasta pluća MRC-5. Ćelije su zračene u dva režima različitim pre-iradijacionim dozama(0,03; 0,05 i 0,07Gy) i istom kurativnom dozom (2Gy) tokom 4 dana. Višekratna primena niskih doza JZ nije značajno smanjila vijabilnost HT-29 ćelija, dok su dve radioadaptivne doze (0,05+2Gy i 0,07+2Gy), adekvatne doze JZ za radioterapijski postulat poštede zdravih ćelija i bolji antitumorski efekat u odnosu na neradioadaptivno zračenje od 2Gy u toku 4 dana. Pokazana je mogućnost modulisanja ćelijskog odgovora na JZ uz pomoć niskih doza JZ koje su praćene dozom od 2Gy (radioadaptivni tip zračenja) u oba dizajnirana režima zračenja. Stepen oštećenja hromozoma za većinu isporučenih doza pokazao dozno zavisni trend. Dozno-zavisno oštećenje naslednog materijala izazvano radioadaptivnim zračenjem potvrđuje hipotezu da je stepen oštećenja zdravih, MRC-5, ćelija manji nego u ćelijama kolorektalnog adenokarcinoma. Fragmentacija DNK je zabeležena za pojedine doze JZ u obe ćelijske linije, a uočena je i razlika u odgovoru zdrave i tumorske ćelijske linije. Detekcijom mutacija primarne sekvence fragmenta p53 gena pokazano je da se broj mutacija povećava sa povećanjem doze JZ. Oba režima radioadaptivnog zračenja, u obe ćelijske linije izazivaju viši nivo ekspresije p53. Ekspresija p38 MAPK proteina u HT-29 ćelijama bila je niža za sve isporučene doze JZ u odnosu na nezračene ćelije. U MRC-5 ćelijama, povišena ekspresija p38 MAPK utvrđena je samo u uzorcima koji su jednokratno primili samo niske doze JZ i dozu od 2Gy dnevno tokom 4 dana, u odnosu na nezračenu kontrolu. Razlike u ekspresiji ispitivanih proteina dobijene nakon primene dva režima radioadaptivnog zračenja posledica su delovanja niskih pre-iradijacionih doza JZ na modulisanje radiobiološkog odgovora obe ćelijske linije. Nivo ekspresije Bcl-2 i Bax proteina i njihov međusobni odnos, u obe ćelijske linije, su odraz različitog radiobiološkog odgovora ispitivanih ćelija koji zavisi od primenjenog režima zračenja.Radiotherapy (RT) is one of the most important treatment modality for solid malignant tumors and it is applied in more than 50% of the patients (52.3%). Radiobiology id scientific discipline which studies the effects of electromagnetic irradiation on biological systems. Radiobiology focuses on the response of the cells, tissues and the organism as a whole to ionizing radiation and studying the mechanisms of radiobiological response. Exposure of cells to low-dose irradiation (priming dose) followed by challenging doses is called radioadaptive radiation. Adaptive response is described as several phenomena: hyperradiosensitivity / radiorezistence, "bystander" effect and radioadaptive effect in sensu strict. Molecular mechanisms underlying the above effects are not sufficiently known. In this study, the response of malignant and healthy cells on various modalities of ionizing radiation is explored in order to improve knowledge of pathways of cell death and survival. Fully understanding the molecular pathways leading to apoptosis or cell survival after exposure to ionizing radiation may be used in finding new and more effective strategies and modalities for the treatment of malignant tumors. The study used two human cell lines: human colorectal cancer HT-29 cell line and the human fetal lung fibroblast MRC-5. The cells were irradiated in two modalities using different pre-irradiation doses (0.03, 0.05 and 0,07Gy) and the same challenging dose (2Gy) for 4 days. Everyday use of low-dose did not significantly reduce the viability of HT-29 cells, while two radioadaptive doses (0.05 + 2Gy and 0.07+2Gy), are adequate doses for sparing healthy cells with better anti-tumor effects. The possibility of modulating the cellular response to the ionizing radiation was shown using low-doses followed by 2Gy (radioadaptive radiation) in both designed regimes of radiation. The level of chromosomal damage showed a dose-dependent trend. Dose-dependent damage to the genetic material caused by radiation confirms the hypothesis that the degree of damage to MRC-5 cells is smaller than the HT29 cells. DNA fragmentation differed between HT29 and MRC-5 cells. Detection of mutations in p53 gene fragment sequence increased with increasing doses. Both irradiation modalities, in both cell lines induce a higher level of p53 expression. Expression of p38 MAPK protein in the HT-29 cells was lower for all delivered doses compared to nonirradiated. In MRC-5 cells, increased expression of the p38 MAPK was found only in the samples that had only received on first day low-doses compared to the control nonirradiated cells. Differences in the expression of the tested proteins reflect different molecular mechanisms activated in normal and tumor cells. The level of Bcl.2 and Bax expression also reflected different radiobiological responses between normal and tumor cells, which depended on the applied irradiation regime