Effects of interleukin-17 on mesenchymal and endothelial cell functions and mechanisms involved

Interleukin (IL) 17 familija citokina se smatra najmanje istraženom citokinskom familijom sa značajnom ulogom u procesu inflamacije. Ubikvitarna rasprostranjenost receptora za IL-17 omogućava ovom citokinu mnogobrojne biološke efekte u organizmu, poput važne uloge u imunskom odgovoru i regulaciji procesa hematopoeze, ali i u progresiji različitih bolesti, uključujući inflamatorna, autoimunska i maligna oboljenja. IL-17 ima ulogu u ćelijskim procesima poput proliferacije i diferencijacije, i to prvenstveno na hematopoetskim matičnim i progenitor ćelijama, pri čemu IL-17 ispoljava različite efekte na proliferaciju i diferencijaciju zavisno od tipa ćelijske loze i stepena diferencijacije ćelija. Takoñe, zbog ubikvitarne rasprostranjenosti svog receptora, IL-17 je uključen u interakcije izmeñu imunskog sistema i somatskih tkiva. Novija istraživanja su pokazala da IL-17 ima i ulogu finog regulatora diferencijacije mezenhimskih matičnih ćelija (MSC, Mesenchymal stem cells), s obzirom na to da stimuliše osteogenu diferencijaciju dok, s druge strane, inhibira adipogenu diferencijciju humanih MSC. Savremena istraživanja biologije MSC ukazala su na širok opseg njihove potencijalne terapijske primene, prvenstveno u regenerativnoj medicini, jer ove multipotentne adultne matične ćelije koje predstavljaju nediferencirane ćelije sa sposobnošću samoobnove, imaju sposobnost diferenciranja u ćelije tkiva mezenhimskog porekla, poput osteoblasta, hondroblasta i adipocita, a prema saznanjima koja imamo danas, i u ćelije tkiva ektodermalnog i endodermalnog porekla. Matične ćelije različitog stepena multipotentnosti izolovane su iz raznih adultnih tkiva, kao i perinatalnih tkiva koja se poslednjih godina sve češće pominju kao povoljan izvor MSC. Meñutim, i pored velikog napretka u ovoj oblasti, nema konačnih saznanja kako o mehanizmima odgovornim za regulaciju višestrukih funkcija MSC, tako i o njihovom ukupnom terapijskom potencijalu. Kako biološke funkcije MSC umnogome zavise od konteksta mikrosredine, ispitivanje interakcija MSC i IL-17 u održavanju multipotentnosti, mobilizaciji i usmerenoj diferencijaciji MSC je od posebnog značaja. Pored mezenhimskih ćelija, IL-17 ostvaruje svoje efekte delovanjem na endotelske ćelije. Jedan od terapijskih ciljeva u regenerativnoj medicini, koji je još uvek nedovoljno objašnjen, je i podsticanje revaskularizacije oštećenog tkiva. Stimulacija postojećih, in situ prisutnih endotelskih ćelija na angiogenezu je jedan od mogućih mehanizama. Efekti IL-17 na endotelske ćelije nisu do sada u potpunosti opisani, i poznato je samo da IL-17 u prisustvu drugih poznatih angiogenih faktora stimuliše sposobnost endotelskih ćelija za angiogenezu. Pored toga, poznato je da se funkcije ćelija kao i delovanje citokina značajano razlikuju u zavisnosti od procenta kiseonika prisutnog u mikrosredini ćelija. Efekat delovanja IL-17 na endotelske ćelije u prisustvu različitih koncentracija kiseonika do sada nije istraživan. Takoñe je još uvek nepoznato da li IL-17 može uticati na diferencijaciju MSC u endotelske ćelije. Da bi se sprovela istraživanja u ovom pravcu, neophodno je uspostaviti pogodan model za diferencijaciju MSC u endotelske ćelije Cilj istraživanja ove disertacije bilo je ispitivanje efekata IL-17 na različite ćelijske funkcije mezenhimskih i endotelskih ćelija u specifičnim uslovima mikrosredine. Analizirano je dejstvo IL-17 na proliferaciju, migraciju, angiogenezu i diferencijaciju ćelija. Istraživani su i molekularni mehanizmi koji omogućavaju finu regulaciju ćelijskih funkcija od strane IL-17, analizom aktivacije signalnih molekula, kao i ekspresije gena i proteina neophodnih za specifične funkcije. Posebna pažnja u istraživanjima bila je posvećena izolaciji, karakterizaciji i endotelskoj diferencijaciji primarnih MSC iz tkiva pupčanika (UC-MSC, Umbilical cord-mesenchymal stem cells). U okviru razjašnjavanja efekata i mehanizama delovanja IL-17 na diferencijaciju mezenhimskih ćelija, primenjena je multipotentna mišja C2C12 ćelijska linija. Uticaj IL-17 na diferencijaciju analiziran je na osnovu ekspresije gena i proteina specifičnih za odreñeni tip diferencijacije: teškog lanca miozina (MyHC, Myosin heavy chain) i miogenina za miogenu, a alkalne fosfataze (ALP, Alkaline phosphatase), Runx2/Cbfa1 (Runt-related transcription factor 2/Core-binding factor subunit alpha-1) transkripcionog faktora i ciklooksigenaze 2 (Cox-2, Cyclooxygenase 2) za osteogenu diferencijaciju. Pored toga, utvrñivano je učešće mitogenom aktiviranih protein kinaza (MAPK) i morfogenetskih proteina kosti (BMP, Bone morphogenic proteins) u IL-17-usmerenoj diferencijaciji C2C12 ćelija. Rezultati su pokazali da IL-17 inhibira miogenu i stimuliše osteogenu diferencijaciju C2C12 ćelija, s obzirom na to da je IL-17-zavisna inhibicija miogeneze povezana sa redukcijom ekspresije iRNK za miogenin, redukcijom ekspresije MyHC i izostankom formiranja miotuba, dok je IL-17-zavisna indukcija osteogeneze povezana sa indukcijom ekspresije iRNK za Runx2/Cbfa1, indukcijom ekspresije Cox-2 i povišenom aktivnošću ALP. Rezultati su takoñe pokazali da IL-17 ostvaruje ove efekte putem aktivacije ERK1,2 MAPK signalnog puta, nezavisno od BMP-Smad signalnog puta. U drugom delu ove studije ispitivan je efekat IL-17 na funkcije endotelskih ćelija na modelu humane endotelske ćelijske linije, EA.hy 926, praćenjem njihove proliferacije, migracije i tubulogeneze u uslovima normoksije i hipoksije. Analizirana je i ekspresija gena za endotelsku azot monoksid sintazu (eNOS, Endothelial nitric oxide synthase) i Cox-2, kao i njihovih proteinskih produkata, budući da ovi molekuli imaju važnu ulogu u procesu angiogeneze. Dobijeni rezultati su potvrdili da IL-17 stimuliše ključne funkcije uključene u proces angiogeneze EA.hy 926 ćelija, poput ćelijske migracije i tubulogneze, kao i ekspresiju eNOS i Cox-2 u ovim ćelijama. Pro-angiogeni efekti IL-17 su pokazani u uslovima normoksije (20% O2). Uslovi hipoksije (3% O2) pokazali su toksično dejstvo na ovu ćelijsku liniju, dok je IL-17 u ovakvim uslovima umanjio broj apoptotičnih ćelija. U okviru trećeg dela ove disertacije MSC su izolovane iz vezivnog tkiva pupčanika, tzv. Vartonove sluzi, umnožene i okarakterisane prema važećim preporukama i kriterijumima Meñunarodnog društva za ćelijsku terapiju. Zatim je ispitan i odreñen optimalni protokol za njihovu efikasnu diferencijaciju u endotelske ćelije, u cilju uspostavljanja novog ćelijskog modela za buduća istraživanja. Princip diferenciranja UC-MSC u endotelske ćelije zasnivao se na inhibiciji signalizacije faktora transformacije rasta (TGF-β, Transforming growth factor beta), i to njegovog receptora, aktivinu-nalik kinaze 5 (ALK5, Activin-like kinase). Na osnovu dobijenih rezultata, zaključeno je da se UC-MSC odlikuju visokom sposobnošću samoobnove i visokim kapacitetom za diferencijaciju kao i da se mogu diferencirati u endotelske ćelije putem inhibicije ALK5 receptoraInterleukin (IL) 17 cytokine family is considered the least explored cytokine family with an important role in inflammation. Due to the ubiquitous expression of its receptor, IL-17 has been implicated in interactions between the immune system and somatic tissues. In this context, recent findings have shown that IL-17 acts as a fine regulator of mesenchymal stem cell (MSC) differentiation. Having in mind that behaviour of MSC depends on the surrounding microenvironment, it is important to analyze the interactions between MSC and IL-17 involved in the maintenance of their multipotency, mobilization and directed differentiation. In addition to mesenchymal cells, IL-17 exerts its roles by acting on endothelial cells as well. Even though IL-17’s effects on endothelial cells have not been fully discovered yet, it is well known that IL- 17, in the presence of other angiogenic factors, has the ability to stimulate endothelial cells to undergo angiogenesis. Furthermore, it is well known that cellular functions, as well as cytokine effects can be significantly modulated by the percentage of oxygen present in their microenvironment. However, effects of IL-17 on endothelial cells in the context of different O2 concentrations have not been explored yet. Also, it is still unknown whether IL-17 can affect endothelial differentiation of MSC, but to address this issue, it is necessary to create a valid model of endothelial differentiation of MSC. The objective of this study was to investigate the effects of IL-17 on different functions of mesenchymal and endothelial cells in specific microenvironmental conditions. The influence of IL-17 on proliferation, migration, angiogenesis and differentiation was analyzed, as well as the molecular mechanisms involved. The activation of various signaling molecules and the expression of genes and proteins involved in specific functions were examined. Yet another objective was to establish an appropriate model for the mesenchymal-endothelial transdifferentiation. For this task primary MSC from umbilical cord tissue (UC-MSC) were isolated and characterized with emphases on their endothelial differentiation. In order to elucidate the effects and mechanisms involved in IL-17 acting on mesenchymal cell differentiation, a multipotent mouse C2C12 cell line was used. The influence of IL-17 on cell differentiation was analyzed based on the expression of genes and proteins specific for the certain type of differentiation: Myosin heavy chain (MyHC) and Myogenin for myogenic, and Alkaline phosphatase (ALP), Runt-related transcription factor 2/Core-binding factor subunit alpha-1 (Runx2/Cbfa1) and Cyclooxygenase-2 (Cox-2) for osteogenic differentiation. Additionaly, the involvement of Mitogen-activated protein kinases (MAPK) and Bone morphogenetic proteins (BMP) in IL-17-directed differentiation of C2C12 cells was investigated. Results obtained demonstrated that IL-17 inhibits myogenic and stimulates osteogenic differentiation of C2C12 cells, by down-regulating the Myogenin mRNA expression, MyHC expression and myotube formation, while up-regulating the Runx2/Cbfa1 mRNK expression, Cox- 2 expression and ALP activity. IL-17 exerted these effects by activating ERK1,2 MAPK signaling pathway, which in turn regulated the expression of relevant genes and proteins to inhibit myogenic differentiation and induce osteogenic differentiation. It was also shown that the induction of osteogenic differentiation by IL-17 is independent of the BMP-Smad signaling pathway. In the second part of this study the effect of IL-17 on endothelial cell functions was investigated using human endothelial cell line EA.hy 926 as a model. The changes in cells’ proliferation, migration and tubulogenesis were analyzed, along with the expression of genes for endothelial Nitric oxide synthase (eNOS) and Cox-2, and their corresponding protein products, since these molecules have important roles in angiogenesis. The influence of the environmental stimuli (normoxia vs. hypoxia) was also investigated. Results obtained demonstrated that IL-17 stimulates crutial events involved in angiogenesis of EA.hy 926 cells, such as cell migration and tubulogenesis, along with the expression of eNOS and Cox-2. However, the effects of IL-17 were dependent on the O2 concentration, since pro-angiogenic effects of IL-17 were noticed in the presence of 20% O2, while 3% O2 exerted toxic effect on this cell line, and IL-17 in these conditions decreased the number of apoptotic cells. In the final task, MSC were isolated from the umbilical cord Wharton’s jelly, expanded in culture and characterized according to the recomendations from the International Society for Cell Therapy. Following this, an optimal protocol for the endothelial diffrentiation of UC-MSC was established. The endothelial-directed differentiation was based on the inhibition of the Transforming growth factor beta (TGF-β) signaling, specifficaly its receptor activin-like kinase 5 (ALK5). Based on the results gained, it was concluded that UC-MSC have a high ability to selfrenew and high diferentiation capacity, as well as that these cells can be differentiated into endothelial cells by inhibiting ALK5 recepto