Terapia celular y génica con timulina E IGF-1 en modelos animales de neuroinflamación

El envejecimiento cognitivo y su expresión más devastadora, la enfermedad de Alzheimer (EA), representan un creciente desafío médico y socioeconómico que requiere vigorosos esfuerzos de investigación para dilucidar los mecanismos fisiopatológicos que intervienen el cerebro y para el desarrollo de estrategias terapéuticas. Más aún, la EA esporádica (EAE) es la patología neurodegenerativa más frecuente y se espera que el número de personas afectadas continúe creciendo de manera exponencial. Desafortunadamente no existe un tratamiento disponible que revierta o prevenga la muerte neuronal que resulta en el inevitable deterioro cognitivo de los pacientes con EA. Es por ello que, la combinación de un diagnóstico temprano y una terapia efectiva resulta imprescindible para frenar el progresivo aumento de casos dado por la mayor expectativa de vida. Desde hace unos años, existe un creciente interés en el potencial de las células madre mesenquimales (MSCs) para implementar medicina regenerativa en el cerebro, ya que han demostrado actividades neurogénicas e inmunomoduladoras. En la presente Tesis Doctoral evaluamos en primer lugar, el efecto de la administración intracerebroventricular (icv) de MSCs derivadas de médula ósea humana (hBM-MSCs) en la memoria espacial y en la morfología del hipocampo de ratas seniles (27 meses). Después del tratamiento, el grupo senil tratado con MSCs mostró una mejora significativa en la memoria espacial, evaluada en el Laberinto de Barnes (BM). Respecto a la morfología del hipocampo, la terapia con MSCs aumentó el número de neuroblastos en el giro dentado, redujo el número de células microgliales reactivas y restauró la pérdida sináptica en comparación con los controles seniles. Llegamos a la conclusión de que las hBM-MSCs inyectadas icv son eficaces para mejorar la memoria espacial y algunas características cerebrales funcionales y morfológicas típicamente alteradas en ratas envejecidas. Para contribuir al estudio de la EA es necesario disponer de modelos animales que recapitulen las principales características patológicas de esta enfermedad. La inyección icv de estreptozotocina (STZ) en ratas constituye un modelo prometedor, ya que los animales desarrollan un estado cerebral insulino-resistente y deficiencias cognitivas. Aunque numerosos estudios han descripto a este modelo como representativo de la EAE, aún se necesitan más estudios para caracterizarlo completamente. En el presente trabajo, evaluamos los efectos a corto plazo de la inyección de STZ-icv a dos dosis, 1 (STZ1) y 3 mg/kg (STZ3), sobre el comportamiento y la morfometría del hipocampo. Encontramos que, después de la administración de STZ-icv, las ratas STZ3, pero no las STZ1, presentaban alteraciones en la memoria espacial en el BM y en la memoria de reconocimiento de objetos. Además, las ratas STZ3 mostraron una reducción del volumen y pérdida de neuronas del hipocampo, junto con un aumento de marcadores de microgliosis y astrogliosis (neuroinflamación). El análisis de Sholl reveló la vulnerabilidad de los astrocitos hipocampales a ambas dosis de STZ. En general, el presente estudio proporciona datos relevantes sobre este modelo de EAE en rata, en el cual solo la dosis alta de STZ induce lesiones neurodegenerativas severas y agudas, asociadas con un proceso inflamatorio. En este modelo de EAE decidimos evaluar la terapia con MSCs puesto que obtuvimos resultados prometedores en los estudios en ratas seniles. Para ello, inyectamos crónicamente MSCs por vía intravenosa (iv). Comprobamos que la terapia celular aumentó el comportamiento exploratorio y de enterramiento defensivo, disminuyó la ansiedad y mejoró la memoria espacial, afectados por la STZ. Un hallazgo interesante es que la terapia celular rescató a los animales de la neurodegeneración, pero no revirtió la pérdida de neuroblastos inducidas por la STZ en el hipocampo. Además, la terapia celular disminuyó significativamente la microgliosis y la disfunción sináptica en el hipocampo. Concluimos que, bajo nuestro protocolo de inyección, la terapia iv con MSCs en ratas con STZ induce a nivel estructural, bioquímico y funcional una neuroprotección integral en el hipocampo que promueve claras mejoras comportamentales. Otro modelo animal de EA, generado por la administración icv de oligómeros del péptido beta amiloide (OβAs) en ratones, fue utilizado en el presente trabajo de Tesis Doctoral. Evidencia considerable indica que los OβAs se acumulan en el cerebro con EA, y están implicados en la disfunción sináptica temprana y en el deterioro de la memoria en dicha enfermedad. Anteriormente, se ha establecido que la exposición de neuronas hipocampales a OβAs induce la internalización de los receptores de insulina (RI) y la inhibición del sustrato 1 del receptor de insulina (IRS-1), generando resistencia a la insulina neuronal. Aunque la insulina parece mejorar la cognición en los individuos controles y en las primeras etapas de la EA, los efectos protectores pueden no observarse en las últimas etapas de la enfermedad. Las posibles explicaciones para esto incluyen la eliminación de los RI de la superficie neuronal y el bloqueo de la señalización del RI debido a la inhibición de IRS-1 instigada por oligómeros. En nuestro estudio, hemos investigado si el factor de crecimiento símil insulina 1 (IGF-1) podría utilizarse para evitar el bloqueo de la señalización mediada por el RI y promover la activación alternativa de vías relacionadas con la insulina, protegiendo así a las neuronas del daño inducido por OβAs. Primero realizamos estudios in vitro que nos permitieron determinar que la exposición a OβAs en cultivos de neuronas hipocampales no afectaba los niveles del receptor IGF-1 en la superficie celular. Para evaluar nuestra hipótesis empleamos in vitro, previo a la exposición a OβAs (500 nM), un vector adenoviral recombinante (RAd-IGF-1) que induce la sobreexpresión de IGF-1. A pesar de observar solo una ligera disminución en la pérdida de espinas dendríticas, la expresión de IGF-1 mediada por el RAd previno la unión de OβAs a las neuronas y la producción excesiva de especies reactivas del oxígeno. A continuación, utilizamos un modelo in vivo en ratones para estudiar el impacto de la inyección icv de RAd-IGF-1, dos semanas antes de la infusión de OβAs-icv. Resulta de interés que, la sobre expresión del IGF-1 en el cerebro de los ratones protege contra el deterioro de la memoria de reconocimiento de objetos inducido por OβAs. Los resultados sugieren que la terapia génica con RAd-IGF-1 es una estrategia prometedora para proteger contra la neurodegeneración y el deterioro cognitivo inducido por los OβAs. Finalmente, teniendo en cuenta que la neuroinflamación es una característica típica tanto del envejecimiento como en la EA, resulta interesante disponer de herramientas para su modulación. En el laboratorio hemos empleado terapia génica con el péptido tímico timulina basada en su rol neuroinmunoendocrino. Actualmente estamos interesados en explorar el potencial antiinflamatorio de la timulina en los modelos animales de neurodegeneración. Para ello, inicialmente, nos propusimos generar una herramienta biotecnológica que nos permita manipular la expresión de la timulina, así fue que construimos un sistema bidireccional regulable Tet-Off de dos vectores (que llamamos sistema bivectoral experimental, ETV), el cual expresa simultáneamente el gen sintético para timulina y el gen para proteína verde fluorescente humanizada (hGFP) y, además, el sistema control correspondiente. La expresión de los transgenes se desactiva en presencia del antibiótico doxiciclina (DOX). ETV se caracterizó in vitro, en diferentes líneas celulares, e in vivo, administrado icv y por vía intramuscular; en todos los casos ETV mostró inducir niveles elevados de timulina y ser eficientemente regulado por DOX. Por tanto, creemos que nuestro sistema bivectorial regulable es una herramienta molecular eficaz para implementar terapia génica antiinflamatoria con timulina, a corto y largo plazo, en modelos animales de inflamación aguda o crónica.Facultad de Ciencias Médica