Bases moleculares de la interacción simbiótica eficiente entre <i>Phaseolus vulgaris</i> y <i>Rhizobium etli</i>

Las leguminosas establecen una asociación simbiótica fijadora de nitrógeno con bacterias del suelo conocidas como rizobios. Cuando la planta crece en condiciones limitantes de nitrógeno comienza un intercambio de señales químicas con especies de rizobios compatibles presentes en la rizósfera, que permite un reconocimiento mutuo muy específico. La bacteria se adhiere a la punta de los pelos radicales, y la planta genera una estructura tubular llamada hilo de infección que permite el avance de la bacteria hacia las células del córtex. Allí se activan las divisiones celulares formando un nuevo órgano llamado nódulo, donde los rizobios son internalizados al citoplasma de las células vegetales y se lleva a cabo la fijación de nitrógeno atmosférico a formas fácilmente asimilables por la planta. Phaseolus vulgaris (poroto) es una leguminosa de origen americano que ha diversificado genéticamente en dos centros geográficos independientes, el Andino y el Mesoamericano. El estudio molecular de la diversidad de rizobios presentes en nódulos ha permitido determinar que Rhizobium etli es la especie que ocupa predominantemente los nódulos de P. vulgaris. A su vez, los cultivares de origen Mesoamericano nodulan preferentemente y de manera más eficiente con cepas que poseen el alelo tipo α en el gen nodC, mientras que las plantas de origen Andino nodulan más eficientemente con cepas con un alelo tipo δ. Este sistema representa un excelente modelo experimental para el estudio de los determinantes moleculares que participan en el reconocimiento específico entre ambos simbiontes y lleva al establecimiento de una interacción preferencial y más eficiente. Estudios previos de nuestro laboratorio permitieron identificar y caracterizar a nivel funcional distintos genes implicados en esta respuesta. Uno de ellos codifica para la subunidad C1 del factor de transcripción NF-Y, el cual es un regulador transcripcional requerido tanto para la infección bacteriana y la organogénesis del nódulo, como para la nodulación preferencial por cepas nodC-α. La subunidad NF-YC1 interacciona con las subunidades NF-YA1 y NF-YB7 formando un trímero funcional en la simbiosis. A su vez, NF-YC1 interacciona físicamente con un factor de transcripción de la familia GRAS denominado SIN1, el cual es requerido para la infección y organogénesis del nódulo, así como también para el desarrollo de raíces laterales, siendo un excelente ejemplo de la interconexión de programas transcripcionales en el desarrollo de dos órganos diferentes. En la presente Tesis doctoral se abordó la caracterización de las bases moleculares de una interacción simbiótica eficiente mediante el análisis transcriptómico por secuenciación masiva de ARN de raíces de plantas de poroto de origen Mesoamericano y Andino inoculadas con cepas tipo nodC-α, nodC-δ o con medio de cultivo a modo de control. Este análisis permitió identificar genes que se expresen de manera diferencial frente a las cepas más eficientes, y además, distinguir las respuestas moleculares específicas de cada cultivar frente a cada cepa. Estos genes codifican proteínas involucradas en diferentes procesos de percepción y señalización, regulación de la transcripción, procesos rédox y en modificaciones de la pared celular y la membrana plasmática, los cuales son requeridos para la iniciación y progresión de los hilos de infección. En una segunda etapa de este trabajo de Tesis se identificaron genes que son regulados de manera directa por los factores de transcripción NF-YC1, NF-YA1 y SIN en etapas tempranas de la simbiosis entre P. vulgaris y R. etli. Para ello se utilizaron plantas que expresan de manera ectópica y constitutiva estos factores de transcripción como fusiones traduccionales al epitope FLAG, las cuales se utilizaron en experimentos de inmunoprecipitación de cromatina seguida de PCR (ChIP-PCR) para identificar genes regulados directamente por dichos factores transcripcionales. Esta aproximación experimental permitió identificar genes que participan en la activación de las divisiones mitóticas y de la infección rizobiana. Por último, para profundizar en el conocimiento sobre la vía de transducción de señales que involucra a NF-YC1, en nuestro laboratorio se realizó un screening de una biblioteca de doble híbrido de levadura para identificar proteínas que interaccionen físicamente con NF-YC1. Uno de los clones identificados codifica una proteína quinasa, a la cual denominamos NF-YC1 Interacting Protein Kinase (NIPK). La interacción física entre NF-YC1 y NIPK fue confirmada mediante ensayos de doble híbrido, complementación bimolecular de fluorescencia y ensayos de co-inmunopreciptación. Posteriormente se caracterizó la localización subcelular de NIPK detectándose tanto en el citoplasma como en la membrana plasmática. La caracterización fenotípica de plantas de P. vulgaris silenciadas en NIPK utilizando dos RNA de interferencia (RNAi) dirigidos a diferentes regiones del mRNA, revelaron que NIPK sería requerido para la organogénesis y desarrollo de los nódulos, así como también la frecuencia de la infección rizobiana. El conjunto de resultados obtenidos en este trabajo de Tesis no sólo contribuyen a comprender en mayor detalle los mecanismos moleculares que gobiernan el establecimiento de una simbiosis fijadora de nitrógeno eficiente entre P. vulgaris y R. etli, sino que también sienta las bases para futuros proyectos de investigación y desarrollo que permitan optimizar la fijación de nitrógeno en una planta de interés agronómico y alto valor social para los pueblos del Noroeste Argentino.Facultad de Ciencias Exacta