El antígeno NcSRS2 de <i>Neospora caninum</i>: su aplicación en el diagnóstico y estrategias de prevención

Neospora caninum es un parásito protozoo responsable de abortos y pérdidas económicas en bovinos. La realización de un diagnóstico serológico preciso y con resultados comparables obtenidos por diferentes pruebas contribuye al manejo de este problema y a encarar medidas de control. Los objetivos de este trabajo fueron evaluar una prueba de ELISA con el antígeno nativo NcSRS2 (p38) de N. caninum para el diagnóstico de la neosporosis bovina en Argentina. Asimismo, se analizó el desempeño de la prueba de ELISA-p38 para identificar y diferenciar ratones inmunizados con una vacuna oleosa de N. caninum elaborada con lisado completo de proteínas solubles y otra sin p38. Se evaluó la protección conferida por esas vacunas frente al desafío con una cepa de alta virulencia en el modelo murino. Se purificó la proteína p38 utilizada para el ELISA mediante cromatografía de afinidad, a partir de columnas de sefarosa con el anticuerpo monoclonal 4.15.15 (IgG2a). La prueba se evaluó localmente con sueros de bovinos naturalmente expuestos de Argentina (n= 336) y de bovinos experimentalmente infectados (n= 36). Los sueros que resultaron positivos o negativos a las pruebas de Inmunofluorescencia inidirecta (IFI) e Immunoblot (IB) fueron considerados como Estándares Relativos de Comparación (ERC) para evaluar la prueba de ELISA-p38. Se determinó la concordancia, sensibilidad (Se) y especificidad (Sp) relativa por medio del análisis de caracterísitica operativa del receptor (ROC) de la prueba de ELISA-p38 respecto al ERC. El ERC se conformó por 94 sueros positivos y 231 sueros negativos a las pruebas de IFI e IB (n= 325). El análisis ROC determinó que la prueba de ELISA-p38 fue altamente precisa (área bajo la curva, AUC= 0,982) usando el punto de corte 0,0905 (índice). La Se y Sp relativa del ELISA-p38 fue 97,8% y 99,5%, respectivamente, con una concordancia casi perfecta (k= 0,97) respecto al ERC. La prueba de ELISA-p38 evaluada localmente ha demostrado un buen desempeño y una adecuada performance para el diagnóstico de la neosporosis bovina en Argentina. Se vacunaron ratones BALB/c con un lisado completo de proteínas solubles de N. caninum (VC), y con un lisado de proteínas solubles sin p38 (VS/p38), y se incluyeron grupos controles PBS (C) y adyuvante (CA). En los grupos VC, VS/p38 y CA se utilizó el adyuvante Montanide™ ISA 206 (Seppic, Francia). Los sueros del grupo VC se consideraron como equivalentes a los que se producirían en una infección natural con las proteínas completas del protozoo cuando se realizaron las evaluaciones serológicas previas al desafío. Al día 35 todos los ratones se desafiaron por vía SC con 2 x 106 taquizoítos vivos/ratón del aislamiento NC-Spain 7 de N. caninum. Se realizó la extracción de sangre en los días 13 y 34, para analizar la producción de anticuerpos mediante IFI y ELISA-p38. En el día 34, se sacrificaron 3 ratones de cada grupo con el fin de medir los parámetros inmunes específicos previo al desafío. Los ratones restantes de cada grupo se sacrificaron al final del ensayo (día 65). Se evaluó la respuesta inmune celular y la protección conferida por las vacunas por medio del cultivo de células esplénicas; obtención de sangre para serología y cerebro, pulmón, corazón, hígado y riñón para histopatología e inmunohistoquímica. La respuesta inmune celular fue evaluada por la medición de la producción in vitro de las citoquina IL-4 utilizando un kit comercial de ELISA. Se evaluó el grado de severidad de las lesiones microscópicas en los cerebros y otros órganos según un puntaje asignado. Mediante la prueba IFI se detectaron anticuerpos en los grupos inmunizados (VC y VS/p38) previo al desafío, mientras que con la prueba de ELISA-p38, se detectaron anticuerpos solo en el grupo inmunizado con el lisado completo de proteínas solubles (VC). En los sueros de los ratones inmunizados con lisado completo de proteínas solubles se detectaron anticuerpos, mientras que en el suero de los ratones inmunizados con proteínas solubles sin proteína p38, no se detectaron anticuerpos, resultando serológicamente negativos a la prueba de ELISA-p38. Se estableció un punto de corte de 0,0932 (índice) para una Se y Sp relativa de 100%, con un valor perfecto de AUC para la prueba de ELISA-p38. La prueba de ELISA-p38 en el modelo murino permitió identificar y diferenciar a los ratones inmunizados con y sin la proteína p38 de N. caninum. Al comparar la concentración de IL-4 en los sobrenadantes de los grupos inmunizados con lisado completo de proteínas solubles y sin p38 previo al desafío, se detectaron niveles superiores de IL-4 para el primer grupo con respecto al segundo. Los ratones inmunizados con la vacuna oleosa de N. caninum sin p38 tuvieron mayor severidad de lesiones en cerebro y pulmón, por lo que se considera que el preparado vacunal sin p38 no otorgó suficiente protección frente al desafío con una cepa de alta virulencia. Por lo tanto, la presencia de esta proteina sería necesaria para generar una respuesta inmune protectora. Sería importante investigar otras proteínas que no estén directamente relacionadas con la protección y analizar su potencial uso como indicadores para la diferenciación de animales vacunados de infectados.La tesis contó con la dirección conjunta de las Dras. Maria Cecilia Venturini y Diana Raquel Bacigalupe.Facultad de Ciencias Veterinaria