Isolamento, avaliação do comportamento de amostras de vírus ectima contagioso e melhoramento de técnicas de diagnóstico e de cultivo in vitro

Ectima contagioso (EC) ou orf é uma doença infecto-contagiosa da pele causada pelo vírus do ectima contagioso (ECV) ou ORFV, que acomete principalmente ovinos e caprinos, e ocasionalmente o homem. Protótipo do gênero Parapoxvírus da família Poxviridae, está amplamente disseminado em todo mundo, inclusive no Brasil, especialmente na Região Nordeste, onde a caprinovinocultura é amplamente praticada para a produção de pele, carne e leite. Em Pernambuco, a doença ocorre de forma endêmica e pode ser confundida com enfermidades vesiculares, como a Febre Aftosa (FA), havendo a necessidade de diferenciação, sobretudo como suporte às ações do Programa Nacional de Erradicação da Febre Aftosa (PNEFA). Uma grande limitação no controle da doença é a dificuldade de replicação do vírus em cultivo celular, visando sua manipulação biotecnológica para a produção de vacinas. O objetivo deste trabalho é isolar e avaliar o comportamento de amostras de ECV em cultura primária de células de córnea fetal caprina, além de estabelecer um diagnóstico molecular eficiente para amostras de campo e avaliar o perfil filogenético das amostras de campo estudadas. Amostras de crostas de 22 ovinos e de sete caprinos que apresentavam sinais clínicos de EC, originários dos Estados de Pernambuco, Bahia, Sergipe e Paraíba, foram inoculadas em monocamadas de células epiteliais de córnea de feto caprino, durante sete passagens consecutivas, a intervalos semanais. Para realização do diagnóstico molecular foi utilizado para amplificação de um fragmento de 235pb do gene do envelope B2L o par de primers, PPP-3 e PPP-4 denominados pan-parapoxvirus. Observou-se em todas as passagens, a partir de 24 horas pós-infecção, efeito citopático (ECP) caracterizado pelo arredondamento celular, fusão com formação de pequenos sincícios, vacuolização e corpúsculos de inclusão citoplasmática, com intensidade de 25% a 100% de desprendimento da camada celular, que variou de acordo com a amostra viral. Conclui-se que as culturas de células primárias de córnea fetal caprina mostraram-se altamente permissíveis à replicação do ECV e que as amostras virais isoladas mostraram-se adaptadas ao cultivo utilizado, com pequena variação entre as amostras virais, e que, a identificação viral através da PCR é um método aplicável ao diagnóstico diferencial de enfermidades vesiculares, sobretudo como suporte às ações do PNEFA, no qual caprinos e ovinos são considerados animais sentinelas. A análise filogenética mostrou que as seqüências de ORFV do Nordeste do Brasil estão altamente relacionadas entre si, com seqüências idênticas acima de 99%. Além de apresentarem mais de 80% de identidade com seqüências de outros isolados de ORFV em todo mundo.Contagious ecthyma is a severe and proliferative viral disease affecting ovine and caprine species, and eventually men, caused by the contagious ecthyma virus (ECV) of the Parapoxvirus genus. The disease is spread worldwide, including in Brazil, where in the state of Pernambuco, due to its endemicity, can be mistaken by other vesicular diseases such as the Foot and mouth Disease, which requires its diagnostic differentiation. Meanwhile, the control of the infection in endemic regions is limited due to the difficulties in replicating the virus in cell cultures, for the development of vaccines. The purpose of this work is to evaluate the behavior of ECV samples in primary cultures of fetal caprine cornea cells, and also to establish an efficient molecular diagnostic method for field samples, and to analyze the phylogenetic profile of the virus samples studied. Crust samples from twenty-two sheep and seven goats from the states of Pernambuco, Bahia, Sergipe and Paraiba presenting the clinical symptoms of EC were inoculated in cell monolayers, during seven consecutive passages at weekly intervals. During all passages, starting at 24 hours post-infection was observed a cytopathic effect (CE) characterized by cell rounding, cell fusion with the formation of small syncytia, cytoplasmic inclusion and vacuolization. The intensity of cell detachment from the layers ranged from 25% to 100% which varied according to the viral sample. We concluded that the primary cultures of the fetal caprine cornea cell appeared highly permissible to replication of ECV and the isolated samples of ECV seemed to adapt to the utilized culture with a slight variation among samples, and the identification by PCR showed to be an applicable method to the differential diagnosis of vesicular diseases, especially to support the actions of PNEFA, where goats and sheep are considered sentinel animals. The phylogenetic analysis showed that ORFV sequences from the northeastern of Brazil are highly correlated showing identical sequences up to 99%. In addition, they present more than 80% sequence identity with other isolates of ORFV worldwide