Desenvolvimento de método de análise de Pterinas por cromatografia líquida acoplada a espectrometro de massas de alta resolução para diagnóstico de Fenilcetonúria atípica

Pterinas são substâncias de ocorrência natural, estruturalmente relacionadas ao grupo das pteridinas. Elas podem existir nas formas conjugada e não conjugada. Dentre as pterinas não conjugadas mais importantes está a tetraidrobiopterina (BH4), que é um cofator essencial na função catalítica de várias enzimas como a fenilalanina hidroxilase (PAH). Uma das aplicações da detecção de pterinas em fluidos biológicos é o diagnóstico de fenilcetonúria (PKU) atípica, um erro inato de metabolismo por deficiência de BH4, que causa progressivamente retardo mental grave, convulsões, retardo psicomotor, comportamento agressivo, entre outros sintomas. Quatro tipos de PKUs atípicas são conhecidas por defeitos na biossíntese ou regeneração do BH4: deficiências de guanosina trifosfato cicloidrolase I (GTPCH I), de piruvoil-tetraidropterina sintase (PTPS), deficiência de diidropteridina redutase (DHPR) e da pterina 4-α-carbinolamina desidratase (PCD). No metabolismo de BH4 podem ser formados 7-biopterina, 7-neopterina, 6-biopterina, 6-neopterina, além de pterina e isoxantopterina. Neste trabalho foi desenvolvido um método analítico baseado na técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas de alta resolução focado na caracterização dos metabólitos de BH4 para diagnóstico de PKU atípica. Após os ensaios de otimização da cromatografia e do modo de varredura de íons de espectrômetro de massas conclui-se que uma coluna de cromatografia líquida de ultra eficiência (CLUE), com partículas de diâmetro de 1,9 μm, foi a mais adequada para separar os isômeros 6-biopteria e 7-biopterina, e o modo de varredura de íons selecionados foi necessário para aumentar a sensibilidade do método e promover a detecção de isoxantopterina, que está em baixa concentração na urina. Com isso, a varredura de íons totais, importante para investigação de possíveis novos metabólitos de BH4, foi realizada simultaneamente à varredura de íons selecionados. O método proposto foi validado para os analitos 6- biopterina, pterina, isoxantopterina, 7-biopterina e 7-neopterina e mostrou boa linearidade, seletividade e repetitividade, entre outros parâmetros avaliados. Os resultados mostraram que para manter as concentrações dos metabólitos de BH4 estáveis por longos períodos as amostras precisam ser submetidas a prévia oxidação antes de serem estocadas. Além da validação e estabilidade, foi estimado o intervalo de referência das pterinas para uma população saudável de 0 a 17 anos. O método desenvolvido se mostrou eficiente para a detecção dos marcadores do metabolismo de BH4 e, consequentemente, para aplicação no diagnóstico de fenilcetonúria atípica