Caracteriza??o bioqu?mico-molecular de cepas de Saccharomyces cerevisiae isoladas e selecionadas para a produ??o de cacha?a com ?nfase na produ??o de compostos aromatizantes.

Programa de P?s-Gradua??o em Ci?ncias Biol?gicas. N?cleo de Pesquisas em Ci?ncias Biol?gicas, Pr?-Reitoria de Pesquisa de P?s Gradua??o, Universidade Federal de Ouro Preto.No Brasil, a cacha?a ? a mais popular bebida destilada produzida pela destila??o de caldo de cana fermentado. A produ??o nacional ? estimada em torno de 1,3 bilh?es de litros por ano, dos quais menos de 1% ? exportado. Como conseq??ncia desta pequena exporta??o, grandes esfor?os tem sido realizados para aumentar a qualidade deste produto e aumentar a participa??o deste produto no mercado internacional. Usualmente o processo de fermenta??o do caldo de cana ? conduzido por uma sucess?o de cepas de leveduras, sendo que a esp?cie de levedura predominante ? a Saccharomyces cerevisiae. Na cacha?a e em outras bebidas como o vinho, tem sido incorporado o uso de cepas selecionadas no processo fermentativo para melhorar as caracter?sticas das bebidas e gerar um produto de melhor qualidade. Neste trabalho, utilizamos quatro cepas oriundas de diferentes localidades geogr?ficas, por?m selecionadas e isoladas pelo mesmo procedimento conforme metodologia desenvolvida em nosso laborat?rio (INPI-MG Protocolo-315) que seleciona leveduras com caracter?sticas desej?veis para a produ??o de cacha?a. Al?m destas cepas outras duas cepas previamente identificadas como resistente e sens?vel a cerulenina e TFL foram utilizadas nos experimentos. Neste trabalho, as cepas LBCM 600, LBCM 601, LBCM 613 e LBCM 632, selecionadas por tal metodologia foram identificadas como S. cerevisiae pela an?lise com enzimas de restri??o da regi?o ITS (internal transcribed spacer region). O polimorfismo do DNA das cepas foi analisado com as t?cnicas de RAPD-PCR, COX-PCR e an?lises de microssat?lites. Nossos resultados demonstraram que a an?lise de microssat?lites permitiu uma n?tida distin??o dentre todas as cepas analisadas, ao contr?rio das t?cnicas de RAPD-PCR e COX-PCR. Isto demonstrou ser necess?rio o uso de diferentes t?cnicas combinadas na an?lise do polimorfismo das cepas. Posteriormente as cepas foram analisadas quanto ? produ??o de alco?is superiores e ?steres atrav?s de cromatografia gasosa, demonstrando que as cepas produzem elevada quantidade de ?lcool isoam?lico, octanoato e decanoato de etila. Por fim os genes BAP2, BAT1, BAT2, ATF2, ADH1 e EEB1 foram analisados em suas express?es por qRT-PCR. Ao contr?rio do esperado, nenhuma correla??o direta p?de ser estabelecida entre o n?vel de express?o destes genes e a produ??o de compostos arom?ticos. Os resultados demonstram que a metodologia de sele??o desenvolvida precisa ser aperfei?oada, sobretudo no que diz respeito ? utiliza??o de outras t?cnicas que possibilitem a identifica??o de caracter?sticas indicadoras por exemplo de uma maior capacidade de produ??o de compostos aromatizantes.In Brazil, cacha?a is the most popular beverage produced by distillation of fermented sugar-cane juice. The national production is estimated to be 1.3 billion liters per year of which less than 1% is exported. As a consequence of such small exportation, big efforts have been made to improve this products quality and increase its role in the international trade market. Usually the sugar-cane juice fermentation process has a succession of yeasts, with Saccharomyces cerevisiae being the predominant species. In the ?cacha?a?, and in other drinks as the wine, it has been incorporate the use of strains selected in the fermentative process to improve the characteristics of the beverage and to generate a product of better quality. In this work, it were used four strains from different geographic locations, selected and isolated by the same procedure according to the methodology developed in our lab (INPI-MG Protocol-315) that selects yeast strains with desirable characteristics for the ?cacha?a? production. Besides these four yeast strains two other strains previously identified as resistant and sensible to cerulenin and TFL were used in the experiments. In this work the LBCM 600, LBCM 601, LBCM 613 and LBCM 632 yeast strains, selected by such methodology were identified as S. cerevisiae by an intergenic transcribed spacer region (ITS) restriction analysis. The yeast strains DNA polymorphism was analized with the RAPD-PCR, COX-PCR techniques and SSR analizes. Our results demonstrated that the microsatellite analizes allowed a clear distinction among all the analized yeasts, unlike the RAPD-PCR and COX-PCR techniques. This demonstrated the necessity to use combined techniques to analize the yeast polymorphism. Subsequently the yeasts were analized for the production of higher alcohols and esters by gas chromatograph assays, demonstrating that the strains produce high amount of isoamyl alcohol, ethyl octanoate and ethyl decanoate. Finally the BAP2, BAT1, BAT2, ATF2, ADH1 and EEB1 genes were evaluated by its expression with qRTPCR. Unless the expected, any direct correlation could be established between the expression levels of these genes and the aroma compound production. The results show that the selection methodology developed needs to be improved, particularly with regard to the use of other techniques that allow the identification of features indicative of such a greater capacity for production of flavor compounds