Avalia??o do efeito do tratamento com benznidazol em combina??o com derivados az?licos na infec??o experimental por Trypanosoma cruzi.

Programa de P?s-Gradua??o em Ci?ncias Biol?gicas. N?cleo de Pesquisas em Ci?ncias Biol?gicas, Pr?-Reitoria de Pesquisa e P?s Gradua??o, Universidade Federal de Ouro Preto.A doen?a de Chagas, causada pelo protozo?rio Trypanosoma cruzi, ? um importante problema de sa?de p?blica e o tratamento dessa parasitose apresenta limita??es relacionadas ? efic?cia e toxicidade dos f?rmacos dispon?veis. Nesse sentido, a terapia de combina??o de f?rmacos parece ser uma abordagem ideal na busca de novos tratamentos, pois pode possibilitar aumento da efic?cia, redu??o da toxicidade e da probabilidade de desenvolvimento de resist?ncia. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento com benznidazol (Bz) quando combinado com os inibidores da enzima esterol C14?-demetilase (CYP51), os derivados az?licos posaconazol (Ps) e ravuconazol (Rv) (ou a pr?- droga do Rv, o E1224), na infec??o por T. cruzi in vitro e in vivo. Inicialmente foi avaliada a efic?cia do Ps em combina??o com Bz durante a infec??o aguda de camundongos pela cepa Y de T. cruzi. O tratamento combinado, utilizando doses sub?timas, foi mais eficaz em induzir cura parasitol?gica quando comparado com a utiliza??o de cada f?rmaco isoladamente, indicando uma intera??o positiva entre Bz e Ps. Quando avaliada a efic?cia do tratamento sequencial com Bz ou Ps administrados em doses ?timas durante um curto intervalo de tempo (10 dias cada), verificou-se que a ordem de administra??o dos f?rmacos interfere no resultado do tratamento, sendo a sequ?ncia Bz seguido de Ps mais eficaz. Al?m disso, a terapia combinada induziu uma redu??o significativa da carga parasit?ria em camundongos infectados pela cepa VL-10 de T. cruzi, altamente resistente ao Bz, quando comparada ?s drogas administradas em monoterapia. Considerando esses resultados promissores, foi a seguir investigada a atividade da combina??o do Bz com o Rv. Inicialmente foram realizados experimentos in vitro para definir a natureza da intera??o entre esses f?rmacos. A princ?pio, foram determinados os valores de IC-50 do Bz e do Rv sobre formas epimastigotas e amastigotas das cepas Y e Colombiana de T. cruzi. A seguir, o efeito de combina??es de Rv e Bz, preparadas de acordo com o m?todo de propor??es fixas, foi avaliado nesses modelos. A an?lise dos resultados foi feita por meio do c?lculo das concentra??es inibit?rias fracion?rias (FICs) e do somat?rio das FICs (?FICs) para cada combina??o. A natureza da intera??o foi classificada em fun??o do ?FICs: sinergismo se ?FIC?0,5; indiferen?a (aditividade) se 0,54. As combina??es de Rv e Bz mostraram-se aditivas, com valores de ?FIC pr?ximo a 1 para ambas as cepas e diferentes formas evolutivas do parasito estudadas. Dessa forma, o pr?ximo passo foi avaliar o efeito do Rv (em forma de pr?-f?rmaco, o E1224) em combina??o com o Bz na infec??o por T. cruzi in vivo. Inicialmente foi realizado um experimento para defini??o das doses de E1224 a serem utilizadas em monoterapia. O pr?-f?rmaco foi efetivo em curar camundongos infectados pela cepa Y de T. cruzi de forma mais eficiente do que o composto precursor, o ravuconazol. N?o foi observado efeito dose-dependente; os tratamentos com doses de 10 a 50mg/kg de peso induziram 71 % a 100 % de cura. De forma diferente, o tratamento dos animais infectados pelas cepas Colombiana e VL -10 foi eficaz em induzir uma intensa redu??o da carga parasit?ria, mas n?o em induzir cura. Finalmente, o tratamento com combina??es de Bz e E1224 administrado a camundongos infectados pela cepa Colombiana resultou em maior taxa de cura, em rela??o ?s monoterapias, quando a terap?utica foi iniciada aos 4 dias ap?s a infec??o. Entretanto, quando usado um protocolo mais estringente, no qual o tratamento foi iniciado aos 10 dias ap?s a infec??o, houve redu??o significativa da carga parasit?ria, mas aus?ncia de cura parasitol?gica. Os resultados obtidos nesse estudo demonstram o benef?cio da terapia da combina??o usando derivados az?licos e benznidazol no tratamento da infec??o experimental por T. cruzi e ampliam os dados pr?-cl?nicos relacionados ao uso de combina??es de f?rmacos no tratamento de protozooses.Chagas disease, caused by the protozoan pathogen Trypanosoma cruzi, remains a challenging infection due to the unavailability of safe and efficacious drugs. Combined therapy is envisioned as an ideal approach since it may improve treatment efficacy whilst decreasing toxicity and the likelihood of resistance development. The objective of this study was to evaluate the effect of treatment with Bz when combined with sterol 14?-Demethylase (CYP51) inhibitors posaconazole (Ps) and E1224 (pro-drug of ravuconazole - Rv) in experimental infection with T. cruzi. Initially, we evaluated the efficacy of Ps in combination with Bz during acute infection of mice with T. cruzi Y strain. The drugs were administered individually or in combination for 20 consecutive days. Bz/Ps combined treatments were found to be significantly more efficacious in inducing higher parasitological cure rates than those observed when the drugs were used alone, indicating a positive interaction between Bz and Ps. In addition, the combined therapy induced a significant reduction of parasite load in mice infected with VL-10, a benznidazole-resistant T. cruzi strain, compared to single administration of drugs. Subsequently, sequential therapy experiments were carried out with Bz or Ps over a short interval (10 days), followed by the second drug administered for the same period of time. It was found that the sequence of Bz followed by Ps provided cure rates comparable with those obtained with the full treatments with either drug alone, with no cures observed for the short treatments with drugs given alone. Considering these promising results, the next step was to investigated the activity of Bz and Rv combinations. First, we performed in vitro experiments to define the nature of interaction between Bz and Rv. IC-50 values for Bz and Rv were determined upon epimastigotas and amastigotes of Y and Colombian strains of T. cruzi. The drug combinations were evaluated on the same models. Drug susceptibility was assessed with a modified fixed ratio isobologram method. Fractional inhibitory concentrations (FICs), sum FICs (?FICs) and an overall mean ?FIC were calculated for each combination. The nature of interaction was classified on the basis of the mean ?FIC as follows: synergy as mean ?FIC4. The interaction between Bz and Rv was indifferent with ?FIC near to 1 for both strains. In this way, it was evaluated the effect of Rv (pro-drug, E1224) in combination with Bz upon in vivo infection. First, an experiment to define the optimal dose of E1224 in monotherapy was performed. The pro-drug of Rv, showed activity higher than demonstrated previously for the parent compound in the model of acute murine infection by strain Y. There was no dose-dependent effect, the treatments with 10 up to 50mg/kg weight for 20 consecutive days induced 71% to 100% of cure. Differently, the treatment of animals infected with Colombian or VL-10 strains was very effective in reducing the parasitemia, but led to nil cure rates. Finally, the effect of the E1224 and Bz combination against epimastigote and amastigote of Y and Colombian strains was evaluated. Additionally, the treatment of mice with E1224 in combination with Bz induced higher cure rate in mice infected with Colombian strain when the treatment started 4 days after infection or a significant reduction of parasite load in treatments started 10 days after infection, compared to single administration of drugs. This study expands the preclinical data on drug combinations and provides the basis for further studies as anti-T. cruzi chemotherapy is moving towards multidrug treatment regimens