Anomalie cromosomiche strutturali come causa di alterata funzionalità genica, piastrinopenia e conseguente suscettibilità allo sviluppo di mielodispasie e/o leucemie.

Il presente studio è stato effettuato su quattro diversi pazienti portatori di anomalie cromosomiche strutturali sia di natura acquisita che costituzionale. Tutti i riarrangiamenti alterano l'espressione di specifici geni e possono essere causativi delle forme di piastrinopenia da cui i nostri pazienti sono affetti. Ciascuna anomalia è stata indagata con metodi di citogenetica standard, di ibridazione in situ fluorescente (FISH), di comparative genomic hybridization su array (a-CGH) e, laddove necessario, sono state utilizzate tecniche di PCR real-time quantitativa e/o Multipainting. In dettaglio vengono presentati i seguenti casi: CASO 1: paziente maschio affetto da anemia aplastica grave con scarsa presenza a livello midollare della componente granulopoietica e la completa assenza di megacariociti. E’ stata evidenziata nel midollo un’ anomalia cromosomica clonale a carico di un cromosoma n° 21. L'analisi di FISH effettuata con la sonda informativa CTD-2235K24 ha evidenziato la delezione degli esoni 2-8 di RUNX1, mentre le sonde BAC RP11-88N2 e RP11-625E21 hanno mostrato una duplicazione invertita delle bande q22.2 e q22.3, confermata poi anche dall'analisi di a-CGH. È stato dimostrato con esperimenti di real-time PCR quantitativa che l’evento di delezione a carico degli esoni 2-8 del gene RUNX1 comporta una significativa riduzione nell’espressione del gene stesso. Tale ipoespressione spiega le condizioni ematologiche del paziente, in particolare la completa assenza di megacariociti, vista la nota importanza di RUNX1 nella maturazione degli stessi e nella produzione delle piastrine. In prelievi successivi il paziente è andato incontro a una riduzione del clone con il cromosoma der(21) ma ha acquisito un secondo clone caratterizzato da una delezione interstiziale delle braccia lunghe di un cromosoma 13: in particolare la regione interessata (13q13.3-q21.31) risulta da letteratura essere spesso associata a sindromi mielodisplastiche (MDS) e pazienti affetti da MDS con del(13q) hanno una prognosi negativa per l’evoluzione in leucemia. Questi due cloni sono stati monitorati nel tempo tramite FISH al fine di mantenere sotto controllo la disfunzione midollare ed eventuali sviluppi mielodisplastici/leucemici. CASO 2: paziente femmina affetta da piastrinopenia cronica. Su prelievi di midollo, sangue periferico e fibroblasti cutanei è stata riscontrata un’anomalia cromosomica costituzionale a carico di un cromosoma n° 21 caratterizzata da un evento di inversione pericentrica. Analisi di FISH hanno dimostrato rottura del gene RUNX1 tra il 4° e il 5° esone. L'analisi di a-CGH ha confermato i risultati di FISH e mostrato anche una duplicazione degli esoni 2-3-4 del medesimo gene, una duplicazione della banda 21q22.2 e una grossa regione di delezione terminale di 2,35 Mb. La FISH effettuata con la sonda fosmidica WI2-1915K14 ha confermato la duplicazione degli esoni 2-3-4 di RUNX1, che sono ritenuti sul braccio lungo del cromosoma invertito, e, con la sonda BAC RP11-88N2, la delezione terminale. La Real-time quantitativa ha mostrato una riduzione nell'espressione relativa del gene RUNX1. Anche in questo caso gli eventi di rottura e duplicazione, di natura costituzionale, spiegano la piastrinopenia di cui la nostra paziente è affetta. CASO 3: paziente maschio con fenotipo clinico suggestivo per trombocitopenia amegacariocitica congenita (CAMT) in assenza, però, delle mutazioni del gene MPL riconosciute come causa diretta della patologia. La CAMT, come le altre sindromi da insufficienza midollare, potrebbe essere uno stadio pre-leucemico, anche se i casi riportati in letteratura sono assai rari. E’ stata evidenziata un’anomalia cromosomica acquisita a carico di un cromosoma n° 1, caratterizzata da un evento di inversione paracentrica con punti di rottura in p13 e p36. Le analisi di FISH effettuate con sonde BAC informative hanno confermato l'evento di inversione e la presenza di due regioni di delezione prossime ai punti rottura, evidenziate prima solo con l'a-CGH. La Real-time quantitativa ha evidenziato una ridotta espressione del gene MPL, il quale non risulta rotto dall'evento di inversione ma solo traslocato in una regione più centromerica dello stesso cromosoma: l’ipotesi di un effetto di posizione sul gene MPL potrebbe spiegare il fenotipo simil-CAMT riscontrato nel paziente. CASO 4: paziente femmina con quadro morfologico del midollo e delle piastrine compatibile con Sindrome di Paris-Trousseau: si tratta di una forma costituzionale di piastrinopenia con inclusione di piastrine caratterizzate da granuli α giganti e causata da delezione terminale di un cromosoma n° 11, in una regione dove è mappato il gene FLI1 (11q24), causativo della patologia. Da analisi su midollo è stato evidenziato un cariotipo complesso caratterizzato dalla presenza di un cromosoma derivativo 11 da traslocazione t(3;11)(q21;q25), di un cromosoma derivativo 2 e da monosomia 3. Analisi di MultiFISH a a-CGH hanno meglio chiarito la natura del riarrangiamento. La regione monosomica del cromosoma 11, confermata con FISH con la sonda BAC RP11-744N12, dimostra la perdita clonale di una copia del gene FLI1: questo spiega il quadro di piastrinopenia della paziente. CONCLUSIONI La rottura del gene RUNX1 (CASO 1 e 2), la perdita di una copia del gene FLI1 (CASO 4) e l'effetto di posizione del gene MPL (CASO 3) comportano disfunzione midollare. Nei casi 1 e 2 la rottura del gene è causa diretta della piastrinopenia di cui soffrono, poiché questo gene è coinvolto nella maturazione dei megacariociti e nella produzione delle piastrine. La Real-time quantitativa ha dimostrato una riduzione nell'espressione relativa di RUNX1. Nel CASO l'effetto di posizione a carico del gene MPL è probabilmente causa del fenotipo simil-CAMT del paziente: la Real-time quantitativa ha confemato una riduzione nell'espressione del gene. Nel CASO 4 un complesso riarrangiamento cromosomico strutturale comporta la perdita clonale di una copia del gene FLI1, che è la causa della piastrinopenia della paziente