Inibidores de quimotripsina do veneno de Bothrops atrox (Serpentes: Viperidae): Caracterização, atividade antimicrobiana e anti-Trypanosoma cruzi

Dissertação apresentada a Universidade Federal de Rondônia, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental para obtenção do título de Mestre.Os venenos de serpentes são compostos por uma complexa mistura de toxinas e outras substâncias bioativas abrangendo um amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas. Cerca de 90% do peso seco desses venenos é constituído de proteínas e peptídeos, englobando uma grande variedade de enzimas como proteases (metalo e serino), fosfolipases A2, L-aminoácido oxidases, esterases e inibidores de serinoproteases. Os inibidores de serinoproteases do tipo quimotripsina presentes no veneno de serpentes têm demonstrado potencial aplicação na regulação de enzimas proteolíticas e por atuar como possíveis agentes antimicrobianos. O principal objetivo deste trabalho é identificar inibidores de quimotripsina presentes no veneno da serpente Bothrops atrox, com ação antimicrobiana e anti-Trypanosoma cruzi. Inicialmente, 10 mg do veneno de B. atrox foram solubilizados e aquecidos em uma solução ácida a 80ºC por 30 min, e o sobrenadante aplicado na coluna C18 acoplada ao sistema HPLC, obtendo-se a eluição de cinco frações. Estas frações foram desidratadas e testadas em ensaios de inibição da quimotripsina, sendo que todas inibiram a ação desta enzima. As cinco frações foram analisadas por espectrometria MALDI-TOF MS onde observou-se a presença de peptídeos e proteínas entre as faixas de 733,63 a 48.443,3 Da, constatando-se que todas as frações apresentam proteínas com massa molecular semelhante a inibidores de serinoprotease do tipo quimotripsina. Na fração 1 foram detectadas um grupo de proteínas na faixa de 7.000 Da e outra de 9.107,70 Da com atividade inibitória de crescimento de Staphylococcus aureus e formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi. A fração 2 apresentou proteínas na faixa de 13 a 14 kDa, que demonstrou a maior atividade contra o crescimento de S. aureus e T. cruzi, comparada as demais frações. Na fração 3, também foi observado a presença de duas proteínas: 8.528,68 e 23.555,52 Da, com atividade inibitória de S. aureus e T. cruzi. E a recromatografia da fração 3 apresentou por espectrometria de massa uma molécula com a massa de 8.527,88 Da e inibição de quimotripsina de 78%. As demais frações demonstraram uma maior variedade de peptídeos e proteínas, necessitando de etapas adicionais de purificação para o isolamento dos inibidores de quimotripsina. Neste estudo, relatou-se a primeira descrição de inibidores de quimotripsina presentes no veneno da serpente B. atrox com ação antimicrobiana contra S. aureus e anti-Trypanosoma cruzi, e estes achados abrem expectativas de utilização destes inibidores como agentes potencialmente terapêuticos