Seleção e caracterização de Nanocorpos de Camelídeos contra o antígeno recombinante do segmento-S de Hantavírus, cepa Araucária

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação: Doutorado em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR) como requisito final para a obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Guerino StábeliAs hantaviroses são doenças emergentes de notificação compulsória transmitidas por roedores. Nas Américas são responsáveis por ocasionar a Síndrome Cardiopulmonar causada por Hantavírus (SCPH) com letalidade de até 50% nos casos confirmados. O diagnóstico precoce da infecção proporciona cuidados e atenção ao paciente reduzindo a elevada taxa de mortalidade e evolução da doença. Dada a importância do desenvolvimento de kits para diagnóstico mais sensíveis e específicos para a patologia, este estudo apresenta nanocorpos ou VHHs de camelídeos contra a proteína recombinante do nucleocapsídeo do hantavírus (rNΔ85) cepa Araucária, circulante no Brasil. Os nanocorpos apresentam características físico-químicas peculiares que os tornam excelentes protótipos para aplicações em diagnóstico e terapêutica, tais como tamanho reduzido, alta solubilidade, além de apresentarem uma notável resistência às variações de pH e ação proteolítica. Para o isolamento dos nanocorpos utilizou-se a tecnologia Phage Display. Assim, foram realizadas sucessivas imunizações de camelídeo Lama glama com a proteína rNΔ85 e a resposta imune monitorada por ELISA. A região codante do VHH foi isolada por RT-PCR a partir de linfócitos periféricos, utilizando oligonucleotídeos específicos. Uma biblioteca imune primária com título de 3x107clones foi construída utilizando o vetor fagomídeo pHEN1. Subsequentemente, os segmentos codantes dos VHHs foram fusionados ao gene da proteína III do capsídeo do fago filamentoso M13K07, constituindo uma biblioteca fágica com um título de 1,7x1011cfu/mL. Após duas rodadas de seleção foram selecionados 80 clones, dos quais 11 foram caracterizados por sequenciamento gênico. As sequências foram separadas em quatro grupos de acordo com a variabilidade apresentada nas regiões determinantes de complementaridade (CDR). Após testes prévios de interação por ressonância plasmônica de superfície (SPR) e imunodetecção por ELISA, o clone VHH KC329708, que demonstrou expressiva capacidade de reconhecimento à proteínar NΔ85, foi selecionado, subclonado em vetor fagomídeo pHEN-6xHistag e submetido a purificação por cromatografia de afinidade em coluna de Ni+2. Após purificação, a cinética de interação dos clones e a proteína recombinante foi determinada por SPR e a especificiade por western blotting, utilizando o anticorpo monoclonal anti-rNΔ85 como referência. Nos testes em sensorchip verificou-se que o VHH, clone KC329708, apresentou um KD=5,52x10-6(M) e cerca de 10RU, em comparação com o anticorpo monoclonal que apresentou um KD=3,38x10-6(M) e 3,5RU, indicando que o VHH KC329708 apresenta uma afinidade significativamente maior à rNΔ85 comparado ao anticorpo monclonal anti-rNΔ85 de murinos. Os resultados obtidos neste estudo suportam a ideia do uso deste VHH como insumo para diagnóstico de infecções por hantavírus devido à sua afinidade à rNΔ85. Adicionalmente, devido às características apresentadas pelos nanocorpos, especulamos o seu uso como intrabodies para rastreamento e inibição da proteína N do hantavírus durante a infecção e replicação viral