Produção e caracterização parcial de nanocorpos ativos contra Crotoxina: uma neurotoxina da serpente Crotalus durissus terrificus.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação: Mestrado em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR) como requisito final para a obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Orientadora: Prof. Dra. Carla Freire Celedônio Fernandes.No Brasil cerca de 7,5 % dos casos de envenenamento ofídico são causados por serpentes do gênero Crotalus, os quais originam uma taxa de mortalidade de 1,8 %. Os efeitos neurotóxicos, miotóxicos e nefrotóxicos ocasionados pelo envenenamento crotálico estão principalmente relacionados à crotoxina (CTX), um heterodímero formado por interações não covalentes entre uma fosfolipase A2 básica (CB) enzimaticamente ativa, e a crotapotina (CA), componente ácido e enzimaticamente inativo. O tratamento é realizado por meio da administração de imunobiológicos derivados de cavalos hiperimunizados. Além do alto custo de produção, os soroterápicos são pouco eficazes na neutralização de toxinas em tecidos profundos e podem causar reações adversas. Assim é crescente a busca por métodos complementares para os casos de envenenamento ofídico. Camelídeos produzem anticorpos funcionais desprovidos de cadeia leve, onde a região de reconhecimento antigênico é formada por domínio único denominado VHH ou nanocorpo. Além de estável a variações de temperatura e pH, importante para tratamento em campo, nanocorpos possuem um décimo do peso dos anticorpos convencionais, baixa imunogenicidade, são capazes de neutralizar toxinas animais e podem ser produzidos em microrganismos. Explorando essas vantagens, este trabalho teve como objetivo selecionar e caracterizar VHH de Lama glama que reconheçam a crotoxina de Crotalus durissus terrificus. Para isso, a tecnologia phage display foi empregada. Após o monitoramento da resposta imune de um Lama glama previamente imunizado com CA, CB e CTX por ELISA, fragmentos VHHs foram amplificados por RT-PCR usando cDNA sintetizado após a extração de RNA de linfócitos periféricos do animal. O repertório gênico de VHH foi inserido no vetor fagomídeo pHEN1 e uma biblioteca primária, com título de 3,6 x 1012 ufc, foi construída utilizando a cepa E. coli TG1. Após a infecção da biblioteca com o fago auxiliar VCSM13, VHHs, expressos fusionados a proteína III da superfície do bacteriófago, foram selecionados utilizando imunotubos adsorvidos com CTX, CA e CB. Dois clones reconheceram CA, enquanto 76 e 58 reconheceram CB e CTX em ELISA, respectivamente. Após o sequenciamento, cinco perfis clonais foram identificados, analisados in silico e depositados no GenBank. O clone KF498604 foi subclonado em vetor pHEN1-6HIS, transformado em cepa E. coli HB2151 e purificado por cromatografia de afinidade em coluna de cobalto. A especificidade deste clone à subunidade CB e a reatividade cruzada com veneno de subespécies de Crotalus durissus foi verificada por ELISA. De acordo com os resultados obtidos, os nanocorpos selecionados podem ser ferramentas interessantes para auxiliar no tratamento do envenenamento crotálico, entretanto a capacidade de neutralização dos clones precisa ser investigada