Caracterização Da Produção De Biofilme Por Isolados De Aspergillus Spp E O Seu Impacto Biológico

In the last decade, the biomedical literature has described that Aspergillus spp. isolates are able to grow adhered to biotic and abiotic surfaces, surrounded by a polysaccharide extracellular matrix that provides protection from physical and chemical agents, such as the immune system and antifungal drugs. This study aims to characterize the biofilm formation by 18 isolates of Aspergillus section Flavi and section Fumigati, also to evaluate its impact in the antifungal susceptibility “in vitro” and in the virulence. The identification of Aspergillus spp. isolates was realized through a polyphasic approach, including phenotypic tests and molecular identification. The in vitro susceptibility profile was evaluated using the broth microdilution method (CLSI, document M38-A2). The biofilm formed by isolates of Aspergillus spp. was quantified using the crystal violet technique and the impact of this biofilm in the antifungals activity was evaluated by the XTT tetrazolium salt. Isolates with higher biofilm formation capacity were selected for micromorphological characterization by confocal microscopy before and after treatment with amphotericin B and voriconazole. The virulence of the strains with higher and lower biofilm formation capacity were evaluated using the experimental model of infection in Galleria mellonella, generating a survival curve. The identification using a polyphasic approach, allowed the accurate identification of all 18 isolates, namely: six A. tamarii, six A. flavus and six A. fumigatus. All isolates presented MIC values against the antifungals tested in accordance to data described in the literature. The A. fumigatus isolates produced more biofilm than A. tamarii and A. Flavus isolates, with no difference between the later two. Biofilm cells from all isolates of Aspergillus spp. were resistant to triazoles and presented varied susceptibility to amphoterin B. The confocal microscopy analyses demonstrated that the biofilm is composed of well delineated and metabolically active hyphae, however, this aspect was greatly altered after exposure to antifungals. Using the G. mellonella invertebrate model, we observed that all isolates were capable of 100% mortality, in 24 hours for invertebrates infected with A. tamarii and A. flavus and in 96 hours for invertebrates infected with A. fumigatus. The high biofilm-forming phenotype did not affect the survival of the invertebrates Our results demonstrate that the antifungals tested have some level of action on the biofilm formed by Aspergillus spp. even at concentrations lower than the MIC value for these isolates. It was not possible to establish a relationship between the biofilm formation capacity and the survival time.Na última década, a literatura biomédica tem descrito que isolados de Aspergillus spp. são capazes de crescer aderidos a superfícies bióticas e abióticas, envoltos por uma matriz extracelular polissacarídica que os protege da ação de agentes físicos e químicos, tais como o sistema imunológico e antifúngicos. O presente estudo teve o objetivo de caracterizar a capacidade de formação de biofilme por 18 isolados de Aspergillus da seção Flavi e da seção Fumigati, bem como avaliar o impacto deste na suscetibilidade aos antifúngicos in vitro e na virulência. A identificação dos isolados de Aspergillus spp. foi realizada através de abordagem polifásica, incluindo testes fenotípicos e de identificação molecular. O perfil de suscetibilidade dos isolados foi avaliado com base no método de microdiluição em caldo (CLSI, documento M38-A2). O biofilme formado pelos isolados de Aspergillus foi quantificado através da técnica de cristal violeta e o impacto deste biofilme sobre a atividade dos antifúngicos foi avaliada pela técnica de coloração com o sal tetrazólio XTT. Isolados com maior capacidade de formação de biofilme foram selecionados para caracterização micromorfológica do biofilme através de microscopia confocal antes e após tratamento com anfotericina B e voriconazol. A virulência das cepas com maior e menor capacidade de formação de biofilme foi avaliada utilizando o modelo experimental de infecção em larvas de Galleria mellonella, sendo gerada uma curva de sobrevida. A utilização da identificação polifásica permitiu a identificação acurada de todos os 18 isolados, a saber: seis A. tamarii, seis A. flavus e seis A. fumigatus. Todos os isolados de Aspergillus spp. apresentaram valores de CIMs frente os antifúngicos testados condizentes com dados descritos na literatura. Os isolados de A. fumigatus apresentaram maior capacidade de formar biofilme do que os isolados de A. tamarii e A. flavus, não havendo diferença na biomassa formada entre estes dois últimos. As células de biofilme de todos isolados de Aspergillus spp. foram resistentes aos triazólicos e apresentaram susceptibilidade variada à anfotericina B. A análise por microscopia confocal demonstrou que o biofilme é composto por hifas bem delineadas e metabolicamente ativas, no entanto, esse aspecto foi bastante alterado após exposição aos antifúngicos. Utilizando o modelo invertebrado G. mellonella observamos que a infecção por todos os isolados resultou em 100% de mortalidade, em 24 horas para os invertebrados infectados com A. tamarii e A. flavus e em 96 horas para aqueles infectados com A. fumigatus. O fenótipo alto formador de biofilme não impactou na sobrevida dos invertebrados. Nossos resultados demonstram que apesar das comunidades de biofilme formadas por Aspergillus spp apresentarem altos valores de CIM frente aos antifúngicos, estes fármacos ainda são capazes de produzir alterações morfológicas na estrutura do biofilme, mesmo quando utilizados em concentrações subinibitórias. Não foi possível estabelecer qualquer correlação entre quantidade de biofilme formada pelo isolado de Aspergillus e sua virulência.Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2017