Ação De Proteínas Isoladas De Plantas Na Hemostasia E Trombose

Protein from plants may act as inhibitors and thus used to assess blood coagulation, thrombosis and inflammation, in order. to determine the role of certain coagulation enzymes in hemostasis. Such inhibitors may be considered for the development of novel antithrombotic drugs. The isolated inhibitors from Enterolobium contortisiliquum (EcTI), Oelonix regia (DrTI), Acacia schweinfurthii (ASTI), and the bifunctional CrataBL protein, a lectin with inhibitory activityextracted from the Crataeva tapia bark, distinctly inhibit proteases, among them, the coagulation enzymes. Our objective was to establish the structure and function relationship of the inhibitors and their effects on thrombus formation. The inhibitors were purified by ion-exchange, molecular exclusion and affinity chromatoqraphies. The homogeneity of the preparations was assessed by SDS-PAGE, reverse phase chromatography and mass spectrometry, depending on the inhibitor. The effect on coagulation was assessed by the partially activated thromboplastin time, TTPa, and thrombin time, TP. The effects on platelet aggregation were investigated in vitro and ex vivo, as well as in the models of arterial thrombosis via injection of rose bengal in mice, and venous thrombosis through vena cava ligation in rats for the estimation of thrombus formation in vivo. DrTI, AsTI and EcTI increased the aPTT in human plasma due to the inhibition of huPK. DrTI differs from AsTI and EcTI by inhibiting FXla, with a Kiapp of 1.3 nM, indicating the dynamic nature of their reactive sites. DrTI, AsTI, EcTI and CrataBL significantly prolonged the time for total carotid artery occiusion in mice compared to the NaCI control. EcTI was also effective in decreasing the venous thrombus (74%, 2 mg/kg). The effects of DrTI, AsTI and EcTI can be attributed to their activities on the contact blood coagulation enzymes and, in the case of DrTI, AsTI and CrataBL, with platelet inhibition, since these proteins inhibited ex-vivo mice platelet aggregation induced by ADP. Although CrataBL has slight inhibitory effect on FXa it has a potent neutralizing effect of heparin activity. In conclusion, the compounds showed antithrombotic action in experimental models of arterial and venous thrombosis, ali interfering in the intrinsic,' but not in the extrinsic coagulation pathway. Only CrataBL was capable of interacting and neutralizing the effect of heparin. As none of the proteins altered the time of bleeding, it is plausible to consider them for therapeutic application, inhibiting thrombus development with a lower hemorrhagic effect. Support by FAPESP, CNPq, CAPES, Ethics Committee N° 179311A utilização de inibidores de origem vegetal em ensaios de coagulação sanguínea, trombose e inflamação contribui para determinar a função específica de enzimas no processo de hemostase e, em consequência, pode levar ao desenvolvimento de drogas antitrombóticas. Os inibidores isolados de Enterolobium contortisiliquum (EcTI), Oelonix regia (DrTI), Acacia schweinfurthii (ASTI), e a proteína bifuncional CrataBL, uma lectina com atividade inibitória extraída da entrecasca Crataeva tapia, inibem distintas proteases como aquelas da coagulação. Nosso objetivo foi estabelecer a relação entre estrutura e atividade dessas proteínas e os seus efeitos na formação de trombos. Os inibidores foram purificados por cromatografias de troca iônica, exclusão molecular e afinidade. A homogeneidade das preparações foi avaliada por SDS-PAGE, cromatografia em fase reversa e espectrometria de massa, dependendo de cada inibidor. A atividade, na coagulação, foi medida pelo tempo de tromboplastina parcialmente ativada (TIPa) e tempo de trombina (TP); na agregação plaquetária, in vitro e ex vivo; nos modelos de trombose arterial, via injeção de rosa de bengala em camundongos e de trombose venosa, via ligadura de veia cava em ratos, para a estimativa da formação de trombos in vivo. DrTI, AsTI e EcTI aumentaram o aPTT no piasma humano devido à inibição de huPK. DrTI difere de AsTI e EcTI pela inibição de FXla, com um Kiapp de 1,3 nM, indicando a natureza dinâmica dos seus sítios reativos. DrTI, AsTI, EcTI ~. CrataBL prolongaram significativamente o tempo de oclusão total da artéria carótida de ratos em comparação com o grupo controle NaCI. EcTI também foi eficaz em diminuir o trombo venoso (74%, 2 mg/kg). Os efeito de DrTI, AsTI e EcTI podem ser atribuídos à suas atividades sobre as enzimas da fase de contato da coagulação sanguínea e, no caso de DrTI, AsTI e CrataBL, associados à inibição plaquetária, uma vez que estas proteínas inibiram a agregação plaquetária induzida por ADP de ratos, ex vivo. Embora CrataBL tenha fraco efeito inibitório sobre o FXa, apresenta potente efeito neutralizador da atividade da heparina. Em conclusão, os compostos mostraram ação antitrombótica em diferentes modelos experimentais de trombose arterial e venosa, todos interferiam na via intrínseca, mas não na via extrínseca da coagulação. Somente CrataBL foi capaz de interagir e neutralizar o efeito da heparina. Nenhuma das proteínas estudadas alterou o tempo de sangramento, sugerindo serem substâncias com potencial valor terapêutico, inibindo o desenvolvimento das tromboses, com menor efeito hemorrágico. Suporte FAPESP, CNPq, CAPES. Comitê ética N° 179311Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2017