Clinical, molecular and immunological characterization of patients with type 1 autoimmune polyglandular syndrome

Introduction: Autoimmune polyendocrine syndrome type 1 (APS1) is an autosomal recessive disorder defined by the association of at least two of the three major diseases: chronic mucocutaneous candidiasis (CMC), hypoparathyroidism, and autoimmune adrenal insufficiency, however, many other autoimmune components may develop. In most cases, APS1 appears in infancy or childhood. The disease is caused by mutations in the AIRE gene, resulting in defective AIRE protein, which is essential for self-tolerance through thymic expression of peripheral self-proteins, and deletion of autoreactive T cells. In Brazil, however, the characteristics of APS1 patients are still unknown. Objective: To define the clinical profile of Brazilian APS1 patients; to perform mutational analysis of AIRE gene; to investigate genotype/phenotype correlations; to perform functional study of a novel mutation; and to measure specific autoantibodies. Patients and methods: Information about clinical history was evaluated by a questionnaire, and antibodies against interferon type I and interleukins 17A, 17F and 22 were measured in the sera of the patients. Genomic DNA was used to perform sequencing of all 14 exons and exon/intron boundaries of the AIRE gene. For localization analysis by immunofluorescence microscopy, HeLa cells were transfected with wild-type and mutant (c.560C>G) plasmids. Results: Thirteen patients with clinical diagnosis of APS1 were identified and in all cases the disease first appeared during infancy or childhood. Twenty different manifestations have been diagnosed. Besides being the first sign in the majority (77%), CMC was also the most frequent manifestation, present in all patients. Hypoparathyroidism was observed in 69% and adrenal insufficiency was diagnosed in 77%, while the complete triad was present in 54% of the sample. Every patient carried defects in AIRE, and among 10 identified mutations, 4 have never been reported (c.560C>G, c.966C>A, c.1096-2A>G and c.1347C>A). The most frequent mutation was the c.967_979del, which accounted for 36% of the alleles. As in other series, we were unable to identify correlations between phenotype and the detected mutations. Mutational analyses of relatives allowed the identification of APS1 in an asymptomatic child. In transiently transfected cells, the mutant c.560C>G protein was observed as abnormal perinuclear aggregates, which suggested the mutation harmful potential. All 10 confirmed APS1 patients that were tested for anti-interferon type I showed positive results, and we have found that anti-interleukin-17A titers were negatively correlated with number of manifestations in each patient. Thirteen patients suspected of having the syndrome were also investigated; one of them displayed another new mutation of AIRE, which is expected to be deleterious according to in silico simulations. Conclusions: We were able to identify 14 Brazilian patients with APS1, one of them still asymptomatic. In our cohort, CMC was the most prevalent disease, while the most common mutation was c.967_979del. We detected 4 novel mutations, and another mutation likely to be deleterious in a patient suspected of having the syndrome was also reported. Titers of anti-interleukin-17A were negatively correlated with number of manifestations. Screening for AIRE mutations and analysis of specific auto-antibodies are useful tools to establish the diagnosis in initial or atypical situations.Introdução: Síndrome poliglandular autoimune do tipo 1 (SPA1) é um distúrbio autossômico recessivo, clinicamente definido pela presença de ao menos dois componentes da tríade candidíase mucocutânea crônica (CMC), hipoparatiroidismo e insuficiência adrenal. Outras doenças autoimunes também podem estar presentes e geralmente as primeiras manifestações surgem na infância. A síndrome é resultante de mutações no gene AIRE, que codifica uma proteína responsável pela manutenção da autotolerância através da expressão, no timo, de proteínas próprias do organismo e deleção dos linfócitos T autorreativos. Entretanto, a apresentação clínica e as características moleculares e imunológicas da SPA1 não são conhecidas no Brasil. Objetivos: Caracterizar o quadro clínico dos pacientes brasileiros com SPA1, pesquisar mutações em AIRE e determinar possíveis correlações entre genótipo e fenótipo, além de avaliar autoanticorpos e realizar estudo funcional de uma nova mutação. Pacientes e métodos: As manifestações clínicas foram avaliadas através de questionário e foram realizadas dosagens de autoanticorpos contra interferon tipo I e interleucinas 17A, 17F e 22. Os 14 éxons do gene AIRE e as regiões intrônicas adjacentes foram analisados através de sequenciamento direto a partir de DNA genômico. Estudo in vitro de uma das mutações identificadas (c.560C>G) foi realizado através de imunofluorescência de células HeLa transfectadas com plasmídeos contendo os genes selvagem e mutado. Resultados: Identificamos 13 pacientes com diagnóstico clínico de SPA1 e em todos eles o primeiro sintoma surgiu ainda na infância. Vinte diferentes manifestações clínicas foram observadas, sendo que CMC esteve presente em todos estes pacientes e foi a primeira manifestação em 77% dos casos. Hipoparatiroidismo foi diagnosticado em 69%, insuficiência adrenal em 77% e a tríade completa foi observada em 54% da amostra. Alterações em AIRE foram encontradas nos 13 pacientes, sendo que 10 mutações distintas foram identificadas, 4 delas nunca descritas (c.560C>G, c.966C>A, c.1096-2A>G e c.1347C>A). A mutação mais frequente, c.967_979del, foi detectada em 36% dos alelos afetados. Assim como em estudos prévios, não foi possível determinar correlações entre genótipo e fenótipo. O rastreamento genético dos familiares permitiu identificar a síndrome em uma criança ainda assintomática. O estudo funcional in vitro da mutação c.560C>G demonstrou acúmulo anormal da proteína no citoplasma, em região perinuclear, sugerindo potencial lesivo da mutação. Altos títulos de anti-interferon tipo I foram encontrados em todos os pacientes com diagnóstico clínico e/ou molecular de SPA1. Além disso, o número de manifestações em cada indivíduo correlacionou-se negativamente aos títulos de anticorpos anti-interleucina-17A. A avaliação de outros 13 casos duvidosos levou à identificação, em um destes pacientes, de outra nova variante do gene AIRE, que, de acordo com análises in silico, é provavelmente deletéria. Conclusões: Identificamos 14 indivíduos com SPA1 no Brasil, sendo que um deles ainda não manifestou clinicamente a doença. O componente clínico mais frequente foi CMC e c.967_979del foi a mutação mais prevalente. Quatro novas mutações em AIRE foram detectadas e ainda relatamos outra nova variante provavelmente deletéria. Identificamos correlação negativa entre títulos de anti-interleucina-17A e número de manifestações. Análise genética e dosagem de anticorpos anti-interferon I podem auxiliar a confirmação do diagnóstico em casos iniciais ou atípicos.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2013 a 2016