Interaction of EGFR and MET in acquired EGFR inhibitor resistance

Non Small Cell Lung Cancer (NSCLC) macht ~ 85% aller Lungenkrebs. EGFR-Mutationen in diesem Tumor sind häufige Ursachen für Aggressivität und stellen somit ein wertvolles therapeutisches Ziel dar. Nach anfänglicher Therapieantwort entwickelt sich die Resistenz jedoch durch verschiedene Mechanismen einschließlich der Überexpression anderer RTKs wie Met oder dem Erwerb von sekundären Mutationen, zum Beispiel T790M. In dieser Studie analysierten wir Resistenzmechanismen mithilfe der humanen EGFR-gesteuerten NSCLC-Zelllinie HCC827. Zunächst wurden resistente Sublinien gegen die EGFR-Inhibitoren erlotinib (HCC827/Erlo) und Gefitinib (HCC827/Gefi) generiert. Vergleichende genomische Array-Hybridisierungs- (aCGH) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs (FISH) Analysen zeigten eine hohe Amplifikation des EGFR-Genlocus in der parentalen Zelllinie, die reduziert war, aber immer noch in den resistenten Sublinien vorhanden war. Die Reduktion des EGFR-Amplikons wurde von einem Gewinn der MET-Genamplifikation begleitet, die interessanterweise ein anderes Muster in den zwei EGFR-Inhibitor-resistenten Modellenaufwies. Die Met-Hochregulation führte zu einer EGFR-Inhibitor-Resistenz in den HCC827/Erlo und HCC827/Gefi Sublinien. Nach der Met-Hemmung durch Crizotinib wurden HCC827/Erlo und HCC827/Gefi erneut gegenüber einer EGFR-Inhibitor-Behandlung sensibilisiert. Als nächstes wurde die Selektion durch zusätzliche Hemmung von Met erweitert. Für die HCC827/Erlo und HCC827/Gefi Zelllinien wurden zwei zusätzliche Sublinen erzeugt: eine, die nur Crizotinib (HCC827/ErloCrizo, HCC827/GefiCrizo) und eine mit kontinuierlicher Anwendung des ersten EGFR-Inhibitors und Crizotinib (HCC827/Erlo+Crizo, HCC827/Gef+Crizo). In den nur mit Crizotinib ausgewählten Sublinen zeigte indirektes aCGH den Verlust von MET, aber keine Änderung oder sogar Zunahme von EGFR-Genkopien. Die gleichzeitige Selektion mit beiden RTK-Inhibitoren führte zu einem ausgeprägten Verlust beider Amplikons. In diesen Sublinen zeigten Kombinationsexperimente mit Crizotinib und EGFR-Inhibitoren keine re-sensibilisierende Wirkung gegenüber EGFR-Inhibitoren. Interessanterweise wurde im Erlo+Crizo-Modell eine neue hochgradige Amplifikation auf Chromosom 17q12 beobachtet, die den Genlocus für SOCS7, ein Gen, das an der JAK/STAT und Met-Signalisierung beteiligt ist, enthält. Darüber hinaus wurden die Mitglieder der ErbB-Familie, AXL und FGFR1, in der EGFR/MET Inhibitor-resistenten Subline signifikant hochreguliert. Zusammenfassend ist in den doppelt selektierten Zellmodellen weder die MET-Amplifikation/- Überexpression noch die T790M-Mutation für die EGFR-TKI-Resistenz verantwortlich.Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for ~85% of all lung cancers. EGFR mutations in this tumor are common causes for aggressiveness and thus represent a valuable therapeutic target. However, after initial therapy response, resistance develops by various mechanisms including overexpression of other RTKs like Met or acquisition of secondary mutations, e.g. T790M. In this study, we analyzed resistance mechanisms using the human EGFR-driven NSCLC cell line HCC827. First, resistant sublines against the EGFR inhibitors erlotinib (HCC827/Erlo) and gefitinib (HCC827/Gefi) were generated. Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) and Fluorescence in situ hybridization (FISH) analyses revealed high-level amplification of the EGFR gene locus in the parental cell line, which was reduced but still present in the resistant sublines. Reduction of the EGFR amplicon was accompanied by gain of the MET gene amplification, which interestingly had a different pattern in the two EGFR inhibitor-resistant models. Met upregulation resulted in EGFR inhibitor resistance in the HCC827/Erlo and HCC827/Gefi sublines. Upon Met inhibition by crizotinib, HCC827/Erlo and HCC827/Gefi were re-sensitized towards EGFR inhibitor treatment. Next, the selection was expanded by additional inhibition of Met. For both the HCC827/Erlo and HCC827/Gefi cell lines two additional sublines were generated: one receiving only crizotinib (HCC827/ErloCrizo, HCC827/GefiCrizo) and one with continuous application of the initial EGFR inhibitor and crizotinib (HCC827/Erlo+Crizo, HCC827/Gefi+Crizo). In the sublines selected only with crizotinib, indirect aCGH revealed loss of MET but no change or even gain of EGFR gene copies. Concomitant selection with both RTK inhibitors resulted in a pronounced loss of both amplicons. In these sublines, combination experiments with crizotinib and EGFR inhibitors showed no re-sensitizing effect towards EGFR inhibitors. Interestingly, in the Erlo+Crizo model, a new high-level amplification on chromosome 17q12 was observed, containing the gene locus for SOCS7, a gene involved in JAK/STAT and MET signaling. Besides that, ErbB family members, AXL and FGFR1 were significantly upregulated in EGFR/MET inhibitor resistant subline. Summarizing, in the double-selected cell models neither MET amplification/overexpression nor the T790M mutation is responsible for EGFR TKI resistance