Transforming growth factor-beta targets Formin-like 2 for Angiopoietin-like 4 secretion during the epithelial mesenchymal transition

Epithelial to Mesenchymal transition (EMT) is a highly dynamic process that plays a crucial role in tumor progression and metastasis. While remodelling of the actin cytoskeleton is a hallmark of EMT, the responsible actin regulating factors are less well understood. Formins are involved in numerous cellular mechanisms, ranging from cytokinesis to cell adhesion and motility. The Rho-GTPase effectors of the formin family compromise the largest group of actin nucleators and are emerging as relevant pharmacological targets. A critical role of Formin-like 2 (FMNL2) in the assembly of junctional actin at newly forming cell-cell contacts in a 3D matrix has been described. This activity originates downstream of Rac1 and is in line with a physical association of FMNL2 and components of the cadherin-catenin complex. FMNL2 was further recently implicated in β1-integrin trafficking as a direct PKC target required for cancer cell invasion. Here we found that transforming growth factor-beta (TGFβ)-driven EMT leads to an upregulation of PKC resulting in the phosphorylation and activation of FMNL2 in epithelial cells. Proteomic screening for TGFβ-mediated phospho-FMNL2 binding partners identified the tumor promotor ANGPTL4 as a specific binding partner. ANGPTL4 has important roles in cancer development and progression including promoting invasion and metastasis. We found that FMNL2 and ANGPTL4 directly interact under TGF-induced EMT. Our data show that FMNL2 is a critical regulator of ANGPTL4 secretion. Secretion of ANGPTL4 is diminished upon loss of FMNL2 and its phosphorylation. We further observed that ANGPTL4 is sequestered in the Golgi apparatus colocalizing with markers of the trans-Golgi network. Live imaging of vesicle secretion from the Golgi confirmed the transient co-localization of ANGPTL4 and FMNL2. Moreover, ANGPTL4 and FMNL2 modulate cell-cell contact integrity and ANGPTL4 silenced cells fail to disassemble their underlying cell-cell contacts to execute EMT. This effect was further enhanced upon FMNL2 knockout using FMNL2 CRISPR/Cas9 cell line. However, re-introduction of ANGPTL4 restored the mesenchymal phenotype and prompted the dissolution of cell-cell adhesions. Finally, we found that cellular invasion promoted by TGFβ depends on FMNL2 and is reduced upon ANGPTL4 silencing. Taken together, our data point towards a crucial role of FMNL2 for EMT via ANGPTL4 secretion.Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) beschreibt einen hochdynamischen Prozess, bei dem Epithelzellen Differenzierungsmerkmale mesenchymaler Zellen entwickeln. Dies spielt eine entscheidende Rolle bei der Tumorprogression und vereinfacht die Metastasierung von Krebszellen. Als Grundlage von EMT sind strukturelle Veränderungen im Aktinzytoskelett notwendig, jedoch sind die verantwortlichen, aktinregulierenden Faktoren nur unzureichend charakterisiert. Formine stellen hierbei eine Proteinfamilie dar, die an zahlreichen, zellulären Prozessen, wie der Zytokinese, der Adhäsion und der Motilität beteiligt ist. Als Rho-GTPase-Effektoren formen Formine die größte Gruppe bekannter Aktinnukleatoren und neuerdings auch pharmakologisch relevante Ziele. In diesem Kontext wurde eine entscheidende Rolle von Formin-like 2 (FMNL2) bei der Assemblierung von Aktinstrukturen an de novo gebildeten Zell-Zell-Kontakten in 3D-Zellkulturmodellen beschrieben. Diese Aktivität entsteht abwärts von Rac1 sowie durch eine direkte Interaktion von FMNL2 und Komponenten des Cadherin-Catenin-Komplexes. Darüber hinaus wurde eine Phosphorylierung von FMNL2 durch PKC als essentiell für den zellulären Stoffwechseln von β1-Integrinen und damit für die Invasion von Krebszellen herausgestellt. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir, dass die Transforming Growth Factor-beta (TGFβ)-induzierte EMT zu einer erhöhten Expression von PKC führt, die in einer aktivierenden Phosphorylierung von FMNL2 in Epithelzellen resultiert. Das proteomische Screening von Phospho-FMNL2-Bindungspartner nach Behandlung mit TGFβ lieferte den Tumorpromotor ANGPTL4. ANGPTL4 spielt eine wichtige Rolle bei der Tumorentstehung und -progression, einschließlich der Förderung von Invasion und Metastasierung. Wir konnten nachweisen, dass FMNL2 und ANGPTL4 im Rahmen der TGFβ-induzierten EMT direkt interagieren. Unsere Daten weisen darauf hin, dass FMNL2 ein kritischer Regulator der ANGPTL4-Sekretion ist, da die Sekretion von ANGPTL4 durch den Verlust von FMNL2 und dessen Phosphorylierung verringert wird. Wir beobachteten weiterhin, dass ANGPTL4 im Golgi-Apparat mit Markern des trans-Golgi-Netzwerks kolokalisiert. Lebendzellmikroskopie der Vesikelsekretion aus dem Golgi-Apparat bestätigte die transiente Kolokalisation von ANGPTL4 und FMNL2. Des Weiteren modulieren ANGPTL4 und FMNL2 die Integrität von Zell-Zell-Kontakten, da ANGPTL4-defiziente Zellen Zell-Zell-Kontakte nicht zerlegen können, um EMT auszuführen. Dieser Defekt war bei Verlust von FMNL2 in einer FMNL2-CRISPR/Cas9-Zelllinie verstärkt. Eine ektopische Expression von ANGPTL4 stellte den mesenchymalen Phänotyp wieder her und bewirkte die Auflösung von Zell-Zell-Kontakten. Schließlich fanden wir heraus, dass die TGFβ-induzierte Zellinvasion von FMNL2 abhängt und durch Verlust von ANGPTL4 reduziert wird. Zusammengenommen weisen unsere Daten auf eine essentielle Rolle von FMNL2 für die ANGPTL4-Sekretion und damit EMT hin