Auswirkungen der Gerüstproteine Gephyrin und Collybistin auf die Funktionalität von inhibitorischen Rezeptoren

Der Glyzin - Rezeptor (GlyR) und der GABAA – Rezeptor (GABAAR) sind ligandengesteuerte inhibitorische Chloridkanäle, welche durch die Aminosäuren Glyzin und GABA aktiviert werden. Als Mitglieder der nikotinischen Azetylcholinrezeptor-Familie (nAChR) besitzen der GlyR und der GABAAR einen pentameren Aufbau. Beim GlyR sind vier α-Untereinheiten (α1-α4 UE) und eine β-UE bekannt die jeweils aus einer extrazellulären N-terminalen Domäne, 4 Transmembrandomänen und einer großen intrazellulären Schleife bestehen. Die GABAARs können sich aus einer Vielzahl von 21 UEs α(1-6), β(1-3), γ(1-3), δ, ε, π, θ, ρ(1-3) zusammensetzen. Eine hohe lokale Konzentration von GlyRs und GABAARs an inhibitorischen Synapsen ist entscheidend für eine effiziente glyzin-/GABAerge Signal-Transmission im Nervensystem und wird durch die Interaktion mit dem Verankerungprotein Gepyhrin gewährleistet. Aufgrund der Dimerisierungs – und Trimerisierungseigenschaften der Gephyrin - Domänen wird angenommen, dass sich unterhalb der postsynaptischen Membran eine hexagonale Matrix ausbildet. In der hexagonalen Matrix entstehen hochaffine Bindestellen für die ß-UE des GlyR und die β-UEs und α-UEs des GABAAR. Die Gephyrin – Bindemotive (gbm) sind in der intrazellulären Schleife (TM3-TM4) der Untereinheiten zu finden. Bei der Akkumulierung von Gephyrin unterhalb der postsynaptischen Membran nimmt der Gehirn-spezifische GDP/GTP Austausch Faktor Collybistin (Cb) eine tragende Rolle ein. So wird angenommen das Cb über die Interaktion der Pleckstrin-homologen Domäne (PH) mit membranständigen PI3P Gephyrin-CbII Komplexe zur postsynaptischen Membran rekrutiert. Ebenfalls eine wichtige Funktion bei der Rekrutierung des Geph-Cb - Komplexes zur Membran nimmt die src homologe 3 (SH3) – Domäne ein. Die SH3 – Domäne agiert als auto – inhibitorische Domäne und belässt Cb in einer inaktiven Konformation. Die Neuroligine (NL) 2 und 4 können mit der SH3 – Domäne des Cb wechselwirken und Cb in eine aktive Konformation überführen. GlyRs welche aufgrund Ihrer fehlenden Wechselwirkung mit dem postsynaptischen Gephyrin-Collybistin-Komplex nicht interagieren können sind extrasynaptisch in der Zellmembran lokalisiert. Die Untersuchungen mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (engl. TEVC) nach heterologer Expression in den Oozyten des afrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis ergaben, dass die intrazellulär lokalisierten Proteine Gephyrin und Collybistin II SH3-, die apparente Glyzin – Affinität des heteropentameren GlyR α1β und des homopentameren GlyR α1-gbm um das 1,5 bis 10-fache verringern, jedoch keine apparente – Glyzin - Affinitätsveränderung beim homooligomeren GlyR α1-wt bewirken. Nach dem Ausschalten der membranwechselwirkenden PH – Domäne von Collybistin II SH3- durch Punktmutationen in der PH – Domäne (RR363-364-NN) ist keine Verringerung der apparenten Glyzin - Affinität mehr zu beobachten. Neuroligin 2 verringert die apparente Glyzin-Affinität des GlyR α1-gbm nach Ko – Expression mit Gephyrin und der inaktiven Collybistin II SH3+ Variante. Gephyrin und Collybistin II SH3- verringern die apparente GABA – Affinität bei GABAAR α1β3 und GABAAR α2β3. Bei GABAAR α2β3 ist dieser Effekt auch auch ohne die Ko – Expression mit Gephyrin zu beobachten. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Gephyrin und Collybistin II SH3- die apparente Glyzin – und Glutamat – Affinität des exzitatorisch fungierenden N-Methyl-D-Aspartat Rezeptors (NMDA), nach der Einklonierung des Gephyrin – Bindemotivs in die NR1 – Untereinheit, verringern. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Interaktion von Gephyrin und Collybistin II SH3- mit GlyR α1-gbm zu einer drastischen Reduktion des partiellen Agonisten Taurin vermittelten maximal induzierbaren Stroms führt. Die Oligomisierungsdomänen von Gephyrin beeinflussen die Verringerung der apparenten Glyzin - Affinität des GlyR α1-gbm. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Auswirkungen der Gerüstproteine Gephyrin und Collybistin durch eine funktionelle Analyse von ionotropen Rezeptoren mittels TEVC charakterisiert werden können. Somit konnte das Ziel der Etablierung einer zur Validierung geeigneten Methode für die Untersuchung von Rezeptoren mit intrazellulären Proteinen erreicht werden. Diese Untersuchungsmethode könnte in Zukunft dabei helfen die Auswirkungen von krankheitsassoziierten Mutationen in Rezeptor – interagierenden Proteinen auf die Rezeptor Funktionalität zu beschreiben.